摘要
紫花苜蓿(Medicagosativa)是全球种植最广、生产效率最高的饲料牧草之一。我国目前仍然是苜蓿干草的第一大进口国，苜蓿产业国际依存度高。紫花苜蓿的株型与其生物产量息息相关。然而，由于紫花苜蓿是同源四倍体的多年生物种，遗传学及分子生物学研究困难，调控紫花苜蓿株型的分子机制还鲜有报道。挖掘并研究调控紫花苜蓿株型的主效基因有助于未来分子设计育种来改善紫花苜蓿株型并提高产量。 本研究在两年内对137份紫花苜蓿核心种质资源的株高、叶长、叶宽、分枝角度、分枝数等株型相关性状开展表型调查，将采集的表型数据，结合实验室前期由全基因组重测序获得的SNP标记进行全基因组关联分析(Genomewideassociationstudy,GWAS),结果表明6号染色体32.8Mb位置基因组区段与生长习性、分枝角度和株高三个株型相关性状均关联。在共同信号峰值附近，对候选基因进行筛选，定位到一个果糖1,6-二磷酸酶编码基因MsPA1(PlantArchitecture1)。 本研究对苜蓿中果糖1,6-二磷酸酶基因家族进行了分析，发现在四倍体紫花苜蓿及其近缘二倍体种截形苜蓿中都含有四个果糖1,6-二磷酸酶编码基因，并且它们呈现出一一对应的关系。为了研究PA1发挥分子功能的场所，本研究将MsPA1和其在截形苜蓿中的同源基因MtPA1分别与细胞质定位的标记基因AtcFBP共转化至拟南芥原生质体中观察亚细胞定位，结果显示MsPA1和MtPA1均能够与AtcFBP共定位,表明PA1在细胞质中定位。从实验室前期组建的紫花苜蓿转录组数据库中检索到MsPA1主要在叶芽、叶和茎中表达，表明MsPA1可能参与了地上部分株型的调控。为了进一步探究PA1基因的组织表达模式，本研究通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法，获得了MtProPA1∷GUS稳定转基因材料。对生长28天的T1代MtProPA1∷GUS转基因报告株系进行GUS染色，结果显示，MtPA1基因在全株均有表达，在茎基部中高表达。以上研究结果表明MsPA1与其同源蛋白MtPA1均在细胞质中定位，并且主要在茎组织中表达。 本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,获得了Mtpa1突变体。对Mtpa1突变体材料生长发育表型进行分析，结果显示与野生型相比，Mtpa1突变体植株在株高、分枝数、展开叶片数、主根长度、一级侧根数、地上部分鲜重、地下部分鲜重、地上部分干重和地下部分干重均显著降低，表明MtPA1影响截形苜蓿的生长发育以及株型结构。本研究还通过稳定遗传转化获得了MtPA1OE过表达植株，可用于MtPA1功能的后续深入研究。 本研究为了寻找导致匍匐和直立极端材料中表型差异的MsPA1自然变异，在两类极端材料克隆MsPA1的编码序列，通过测序分析发现两个SNPs与表型关联，并根据这两个SNPs从两类极端材料中分离得到四种MsPA1单倍型(MsPA1Hap1、MsPA1Hap2、MsPA1Hap3和MsPA1Hap4)。体外酶活检测实验表明MsPA1Hap4酶活性显著高于其他三种单倍型。为了进一步探究SNPs造成MsPA1各单倍型酶活性差异的原因，本研究进行了非变性凝胶电泳实验，结果表明各单倍型蛋白聚合形式无明显差异。进一步地,微量热泳动实验结果表明MsPA1Hap4蛋白与底物果糖1,6-二磷酸(Fructose-1,6-diphosphate,F-1,6-BP)之间的亲和力较其他三种单倍型更高。以上研究结果初步表明，MsPA1基因编码区的SNPs造成编码氨基酸的改变，使各单倍型蛋白与底物之间亲和力的不同，造成酶活性的差异。 综上所述，本研究通过GWAS分析定位到调控紫花苜蓿株型的主效基因MsPA1。MsPA1与其在截形苜蓿中的同源蛋白MtPA1均在细胞质中定位，并且都在茎组织中高表达。MtPA1在截形苜蓿中会影响植株生长发育以及株型结构。此外本研究还鉴定到导致两类极端材料表型差异的MsPA1自然变异位点，并初步证明了该位点的自然变异能够导致MsPA1不同单倍型酶活的差异。本论文的研究结果为进一步在苜蓿中研究PA1对植物生长发育和株型的调控提供了研究基础，并为未来育种工作提供了候选遗传位点。
NETL