摘要
目的：为进一步研究银杏叶提取物干预博霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响，并观察它对Nrf2、HO-1蛋白等表达影响，探讨银杏叶提取物延缓肺纤维化及抗氧化作用机制，为银杏叶提取物治疗肺纤维化临床治疗提供一定实验性依据。 方法：将60只健康雄性SPF级SD大鼠按照随机数字法等量为4组，分别为空白对照组、模型组（即博来霉素组）、吡非尼酮组、GBE组（即银杏叶提取物组），每组分配各15只。将所有60只大鼠适应性喂养7天后进行造模，空白对照组使用单次气管内注射0.9%氯化钠溶液（NaCl溶液）（5mg/kg），其余组别大鼠使用单次气管内注射博来霉素（BLM）（5mg/kg）进行造模处理。造模当日作为记录第0天，造模后在第14天在各组随机选取一只大鼠处死，去肺组织检验确认是否造模成功，在造模第15天开始实行药物灌胃，对空白对照组与模型组使用0.9%氯化钠溶液（NaCl溶液）灌胃，吡非尼酮组使用吡非尼酮灌胃，银杏叶组使用银杏叶提取物灌胃，每组每日各灌胃一次，连续执行28天。并在灌胃后的第14天、28天各组选取6只小鼠，禁食24小时后处死后进行取材。取出肺组织后，将大鼠右肺进行固定、包埋，处理好后进行苏木素-伊红（HE）、马松（Masson）染色，观察大鼠肺组织并评估大鼠肺组织肺纤维化情况，并采用Szapiel评分评估各组大鼠肺部肺纤维化程度；将大鼠左肺处理后，使用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测法检测肺组织Nrf2、HO-1等蛋白表达。 结果：1.大鼠一般情况：与空白对照组对比，其余三组小鼠精神状况均有不同程度的萎靡。在整个实验期间，空白对照组大鼠精神状态较好，皮肤毛发顺滑，色泽鲜亮，呼吸平稳，食欲较好，对外界刺激敏感，体重增长较其他组明显，整个实验未有死亡情况；模型组大鼠精神状态差，皮肤毛发色泽暗淡，呼吸喘促，食欲不佳，对外界刺激迟钝，爪甲紫暗，体重明显减轻；吡非尼酮组与GBE组两组大鼠在造模后，精神、皮毛色泽、呼吸、食欲，机体反应等与模型组状况相似，经灌胃相应药物后，在第14天，上述情况稍有好转；在第28天情况对比第14天明显好转，各方面状态均有较好改善，但对比空白对照组，各方面状态稍显逊色。在整个实验期间共死亡5只大鼠，空白对照组模型组、吡非尼酮组与GBE组各死亡1只、2只、1只、1只。 2.HE染色结果：空白对照组在造模后第14天、28天大鼠肺组织结构清晰无明显异常，肺泡内未见炎症表现；模型组在第14天可见大鼠肺内组织可见胶原沉积、结构破坏，肺泡壁变薄，肺泡间隙增厚，可见明显炎症细胞浸润；第28天可见大鼠肺组织见明显胶原沉积、结构破坏严重，肺泡壁间隔显著增厚、肺泡腔内炎性细胞广泛浸润；吡非尼酮组和GBE组：在第14天、28天肺组织胶原沉积、肺泡壁间隔厚度及炎症细胞浸润程度比同期模型组小。与空白对照组相比，第14天、28天模型组、吡非尼酮组和GBE组肺泡炎积分显著升高（P＜0.05）；和模型组相比，第14天、28天吡非尼酮组和GBE组肺泡炎积分明显下降（P＜0.05）；和吡非尼酮组比较，在第14天和28天GBE组积分高，差异无统计学意义（P＞0.05）。 3.Masson染色结果：造模后第14天、28天空白对照组大鼠肺组织无胶原纤维增生，肺内组织结构正常，蓝染不明显；模型组第14天胶原纤维增生不显著，肺实质结构破坏不明显，蓝染不显著，面积较小；第28天肺组织纤维化严重，肺组织结构紊乱，染蓝区域较大，染色较明显；吡非尼酮组和GBE组在14天少许胶原纤维增生，肺实质结构破坏不明显，第28天可见肺组织蓝色胶原纤维，结构破坏，蓝染面积及颜色深度对比同期模型组其小。与空白对照组相比，第14天、28天模型组、吡非尼酮组和GBE组肺纤维化积分升高（P＜0.05）；和模型组组相比，第14天、28天吡非尼酮组和GBE组肺泡炎积分下降（P＜0.05）；和吡非尼酮组比较，在第14天和28天GBE组积分低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4.Westernblot法检测：（1）Nrf2蛋白表达：与空白对照组相比，模型组、吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天Nrf2蛋白表达水平显著升高（P＜0.0001），吡非尼酮组和GBE组第14天差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天Nrf2蛋白表达水平明显升高（P＜0.0001）；和吡非尼酮组比较，GBE组在这14天差异无统计学意义（P＞0.05），在第28天Nrf2蛋白表达水平高（P＜0.05）。（2）HO-1蛋白表达：与空白对照组相比，模型组、吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.0001），吡非尼酮组和GBE组第14天差异有统计学意义（P＜0.0001）；与模型组比较，吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天HO-1蛋白表达显著上升（P＜0.0001）；与吡非尼酮组比较，GBE组第28天差异无统计学意义（P＞0.05），第28天HO-1蛋白表达量升高（P＜0.0001）。（3）纤维化指标：CollagenⅠ:与空白对照组相比，模型组第14天、第28天CollagenⅠ蛋白表达水平升高（P＜0.01），吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，吡非尼酮组和GBE组组第14天、第28天CollI蛋白表达水平显著下降（P＜0.001）；与吡非尼酮组比较，GBE组组第14天、第28天差异无统计学意义（P＞0.05）；CollagenⅢ:与空白对照组相比，模型组和GBE组第14天、第28天CollagenⅢ蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,吡非尼酮组在第28天差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，吡非尼酮组和GBE组第14天、第28天CollagenⅢ蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）；与吡非尼酮组比较，GBE组第14天、28天差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：1.银杏叶提取物能够改善由博来霉素诱导大鼠的肺纤维化，从而发挥抗纤维化作用； 2.银杏叶提取物可通过激活Keap1/Nrf2信号通路，提高机体抗氧化能力，降低肺脏氧化应激水平，而减轻PF模型鼠肺损伤。
NETL