中华绒螯蟹血淋巴细胞外泌体蛋白鉴定及四跨膜蛋白、甘露糖结合蛋白的免疫功能研究

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中文摘要：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗称大闸蟹，是一种在我国分布范围较广的水产养殖品种，因其具有产值高、市场大的优点，养殖规模迅速扩大，同时也出现了多种由细菌、病毒及其他病原微生物引起的水产病害，对我国中华绒螯蟹养殖业造成了重创，因此对中华绒螯蟹免疫防御机制的研究十分迫切。基于本课题组之前对中华绒螯蟹“颤抖病”及其病原中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasmaeriocheiris)的研究，本文选择中华绒螯蟹螺原体作为病原侵染中华绒螯蟹个体，待宿主发病后分离出血淋巴中的外泌体，通过TMT标记定量的分析方法，分析了外泌体中差异表达蛋白的功能；其次，在刘敏[1]的研究基础上，研究了中华绒螯蟹四跨膜蛋白(EsTetraspanin)对血淋巴细胞吞噬作用的影响；最后，基于位盼盼[2]的研究基础，在细胞水平上进一步探究了中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白(EsMBP)的免疫功能。以下为本文的研究结果： 1中华绒螯蟹血淋巴细胞外泌体的分离及蛋白质组学分析首先从被螺原体侵染且发病的中华绒螯蟹个体中抽取血淋巴，然后通过超速离心分离出一种囊泡结构，透射电镜观察到该囊泡结构呈球形，边缘清晰、形态完整，粒径分析结果显示正常组的粒径大小约为52.02nm，螺原体侵染组的粒径大小约为53.9nm，综合形态和粒径两大特征，确定分离出的囊泡结构为外泌体。随后通过TMT标记定量的方法对外泌体蛋白进行蛋白质组学分析，共筛选出226个差异表达蛋白，其中有134个上调蛋白，92个下调蛋白，并且包含多种与甲壳类免疫相关的蛋白如抗脂多糖因子(ALFs)、丝氨酸蛋白酶(SPs)、酚氧化酶原(proPO)、凝集素(lectin)、四跨膜蛋白(Tetraspanin)等。细胞免疫是甲壳动物非常重要的免疫方式，外泌体差异表达蛋白GO功能注释也证实细胞加工、绑定和细胞部分的富集蛋白数量较多。KEGG分析发现差异表达蛋白富集在黑色素生成信号通路中，进一步证实中华绒螯蟹通过黑色素抵御病原的入侵。最后通过WesternBlot验证了外泌体中EsTetraspanin的存在。以上结果证明了外泌体在中华绒螯蟹免疫机制中的重要作用，同时也为进一步研究EsTetraspanin的免疫功能打下基础。 2中华绒螯蟹四跨膜蛋白(EsTetraspanin)在血淋巴细胞吞噬过程中的作用通过免疫荧光发现，在中华绒螯蟹血淋巴细胞中，EsTetraspanin和肌动蛋白共定位于细胞膜上，说明EsTetraspanin与肌动蛋白存在相互作用，提示EsTetraspanin可能会参与到血淋巴细胞的吞噬作用。为了验证EsTetraspanin对血淋巴细胞吞噬作用的影响，首先在个体水平上沉默了EsTetraspanin，体外培养血淋巴细胞，并与FITC标记的灭活螺原体共孵育，发现EsTetraspanin的沉默会降低血淋巴细胞的吞噬活性，减少吞噬数量；然后在体外培养正常的血淋巴细胞，用EsTetraspanin的兔多克隆抗体对血淋巴细胞进行封闭，后进一步与FITC标记的灭活螺原体共孵育，发现抗体封闭之后血淋巴细胞的吞噬率和吞噬数量也显著低于对照组。以上结果均说明EsTetraspanin可以通过调控血淋巴细胞的吞噬活性来参与中华绒螯蟹的细胞免疫以抵御螺原体的侵染。 3中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白(EsMBP)的免疫功能研究首先在体外培养中华绒螯蟹血淋巴细胞，发现EsMBP在血淋巴细胞的细胞质和细胞膜均有分布。EsMBP抗体封闭和螺原体感染后，血淋巴细胞形态、细胞活力相对于对照组显著下降，而细胞内的螺原体拷贝数显著上升。该结果说明EsMBP抗体封闭会降低血淋巴细胞对螺原体的抵抗能力。EsMBP在小鼠巨噬细胞过表达后再用螺原体感染，细胞形态、细胞活力相对于对照组显著上升，而细胞内的螺原体拷贝数显著下降。该结果说明EsMBP过表达增强宿主细胞对螺原体的抵抗能力。通过免疫荧光发现在中华绒螯蟹血淋巴细胞中，EsMBP和肌动蛋白存在共定位的情况，提示EsMBP可能会参与到血淋巴细胞的吞噬作用中。在个体水平上沉默了EsMBP后，体外培养中华绒螯蟹血淋巴细胞并与FITC标记的灭活螺原体共孵育，结果发现EsMBP的沉默会降低血淋巴细胞的吞噬活性和吞噬数量。综上所述，EsMBP可以增强宿主的免疫力，以抑制螺原体对宿主的侵染。

作者：

刘鸿丽

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关键词：

中华绒螯蟹血淋巴细胞四跨膜蛋白甘露糖结合蛋白免疫功能

授予学位：

硕士

学科专业：

水产;水产养殖

导师：

孟庆国

学位年度：

2022

学位授予单位：

南京师范大学

语种：

中文

中图分类号：

Q95