摘要
中华绒螯蟹“颤抖病”是河蟹养殖中一种危害极大的疾病，其病原是中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasmaeriocheiris)。前期研究表明，中华绒螯蟹螺原体首先通过鳃或体表入侵河蟹体内，然后侵染血淋巴细胞并在其中繁殖，随后通过血淋巴循环侵染到神经、肌肉等组织。甲壳动物抵御病原侵染依赖先天免疫，其中血淋巴细胞介导的吞噬作用是一种重要的防御机制。本课题组前期研究证明了中华绒螯蟹14-3-3ζ蛋白(Es14-3-3ζ)和中华绒螯蟹Rab7蛋白(EsRab7)在河蟹抵御螺原体侵染过程中发挥重要作用并筛选出两种microRNA分别靶向Es14-3-3ζ和EsRab7。本文在此基础上在个体和细胞水平上探究两种蛋白及其靶向microRNA对细胞吞噬、细胞凋亡的调控，为进一步探究中华绒螯蟹抵御螺原体侵染的机制奠定基础，本文主要从以下三个方面展开： 1.中华绒螯蟹14-3-3ζ蛋白在吞噬螺原体过程中的作用 螺原体感染后Es14-3-3ζ在河蟹神经组织中表达呈先下调后上调的趋势；同样螺原体感染后Es14-3-3ζ在原代培养的血淋巴细胞中表达显著上调，说明Es14-3-3ζ参与螺原体侵染的过程。利用体外转录合成的dsRNA将Es14-3-3ζ沉默后，血淋巴细胞中抗菌肽基因(EsALF1、EsALF2、EsALF3)和免疫相关基因(EsRelish、EsERK、EsRab7)显著下调；Es14-3-3ζ沉默后再用螺原体感染河蟹，血淋巴细胞中螺原体拷贝数显著增多，河蟹存活率显著降低。Es14-3-3ζ沉默后血淋巴细胞对螺原体的吞噬率和吞噬指数均显著降低。果蝇S2细胞中过表达Es14-3-3ζ后，细胞对螺原体的吞噬能力显著增强。激光共聚焦分析显示Es14-3-3ζ与微丝和溶酶体存在明显的共定位，且过表达Es14-3-3ζ会促进螺原体与溶酶体的融合。以上结果表明，Es14-3-3ζ通过促进抗菌肽的表达和细胞吞噬作用帮助宿主抵御螺原体的侵染。 2.中华绒螯蟹Rab7蛋白在吞噬螺原体过程中的作用 螺原体感染后，EsRab7在河蟹神经组织中表达呈显著上调的趋势，说明EsRab7参与螺原体侵染的过程。利用体外转录合成的dsRNA将EsRab7沉默后，血淋巴细胞中抗菌肽基因(EsALF1、EsALF2、EsALF3)显著下调；EsRab7沉默后再用螺原体感染河蟹，血淋巴细胞中螺原体拷贝数显著增多，河蟹存活率显著降低。EsRab7沉默后检测血淋巴细胞对螺原体的吞噬率和吞噬指数均显著降低。果蝇S2细胞中过表达EsRab7后，细胞对螺原体的吞噬能力显著增强。激光共聚焦分析显示，EsRab7与微丝和溶酶体存在明显的共定位，且过表达EsRab7会促进螺原体与溶酶体的融合。以上结果表明，EsRab7通过促进抗菌肽的表达和细胞吞噬作用帮助宿主抵御螺原体的侵染。 3.microRNA靶向调控中华绒螯蟹Es14-3-3ζ和EsRab7的吞噬作用 转染化学合成的microRNA模拟物或抑制剂至原代培养的血淋巴细胞24h后检测靶基因的表达，结果显示miR-2309和miR-131-3p可以分别沉默Es14-3-3ζ和EsRab7。过表达miR-2309后，血淋巴细胞对螺原体的吞噬能力显著下降，细胞凋亡率显著上升；抑制miR-2309后，血淋巴细胞吞噬活性显著上升，细胞凋亡率显著下降。过表达miR-131-3p可以降低血淋巴细胞对螺原体的吞噬能力并减少细胞凋亡；抑制miR-131-3p可以提高血淋巴细胞的吞噬活性并促进细胞凋亡。此外，双荧光素酶报告实验显示miR-131-3p前体同样可以靶向EsRab7从而显著降低报告基因荧光素酶活性。以上结果说明，miR-2309可以通过靶向Es14-3-3ζ负向调控细胞吞噬作用并正向调控细胞凋亡，miR-131-3p及其前体可以通过靶向EsRab7负向调控细胞吞噬作用和细胞凋亡。
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