摘要
大豆(Glycinemax)是重要的粮油兼用作物，是优质植物蛋白和油脂的来源。菜豆普通花叶病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV)引起的大豆花叶病是大豆生产中的一种常见病害，严重影响大豆产量与质量。构建病毒侵染性克隆能够用于研究病毒基因组结构、明确病害特性、探讨病毒与寄主相互作用等。自1981年第一个植物病毒侵染性克隆构建成功以来，更多的侵染性克隆被构建和改造，成为研究天然植物病毒的有用工具。然而，由于马铃薯Y病毒属病毒(Potyviruses)的特性，它比其他病毒更难构建侵染性克隆。随着分子生物学技术的进步，Potyviruses也能在短期内获得稳定的侵染性克隆。本研究探讨了克服Potyviruses长而复杂基因组组装的障碍以及解决Potyviruses基因产物抑制宿主菌生长问题的有效策略。在酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)中通过同源重组系统(homologousrecombination,HR)一步构建了BCMV侵染性克隆，取得了以下主要结果: (1)构建BCMV全长cDNA侵染性克隆 本研究通过四次分段PCR扩增获得BCMV-RD03的全长基因组，再构入穿梭质粒pCB301-2μ-HDV中，在酵母菌内完成病毒基因组与质粒载体的连接，这一方法克服了Potyviruses在构建侵染性克隆中的两大障碍。构建成功的BCMV侵染性克隆pCB-BCMV-RD03对本氏烟(Nicotianabenthamiana)和大豆都有侵染性，接种发病率分别为71.88％和81.25％。后续实验发现pCB-BCMV-RD03对病毒其它常见寄主:菜豆(Phaseolus.vulgaris)、豌豆(Pisumsativum)、赤豆(Vignaangularis)和蚕豆(Viciafaba)也具侵染性。构建的BCMV侵染性克隆可为研究该病毒的症状、复制、细胞间运动、长距离运动、致病性及病毒与寄主作用机制提供了有力的分子工具。通过实验发现，由于pCB301-2μ-HDV包含35S启动子，仅使用酵母质粒去摩擦寄主即可使寄主植物发病，大大地简化了接种方法，有力地促进了病毒相关的研究。 (2)改造BCMV侵染性克隆 实验发现，当片段两端包含50nt左右同源序列时，酵母内HR成功率高且质粒稳定。使用酵母内HR对pCB-BCMV-RD03进行改造，进行截短或插入GFP序列。改造后获得的一个只含ORF的侵染性克隆和两种插入GFP的侵染性克隆对本氏烟和大豆均有侵染性，但尚未成功在植物中成功表达GFP蛋白。酵母内HR能够快速构建并改造BCMV侵染性克隆，这为构建其他病毒的侵染性cDNA克隆提供了一种有用的克隆策略。另外还对P3蛋白中的5组疏水性氨基酸进行定点突变，试图探究影响BCMV-RD03株系侵染本氏烟的关键位点。
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