摘要
目的: 卵巢癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，由于早期缺乏有效的诊断方法，大多数患者发现时已是晚期。据最新统计，2020年全球新增卵巢癌患者313959例（占所有新发癌症的1.6％），死亡患者207252例（占所有死亡病例的2.1％），已成为全球女性第八大癌症。目前卵巢癌的治疗仍以肿瘤细胞减灭术联合化疗为主，尽管近年来多种靶向药物的应用，开辟了卵巢癌治疗的新时代，但对于远期生存率的改善仍不满意。因此，从分子水平揭示卵巢癌发生发展的潜在机制，寻找有效的肿瘤标记物及治疗靶点，对于卵巢癌的诊断、疾病监测及治疗十分重要。NDUFC1,是人类NADH-泛醌氧化还原酶（复合物Ⅰ）的附属亚基，具有76个氨基酸，位于线粒体内膜，参与复合物Ⅰ的组装及维持结构的稳定性。近期研究证实，NDUFC1在胃癌及肝癌中表达上调，导致复合物Ⅰ功能障碍，进而促进癌症的发生发展。然而目前尚无其对卵巢癌发生发展作用的相关研究，前期研究中，我们采用生物信息学技术分析发现NDUFC1在卵巢癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织，本研究将进一步验证NDUFC1在卵巢癌组织中的表达，分析其表达与卵巢癌患者病理资料及预后的相关性。并通过一系列体内外实验，探讨NDUFC1对卵巢癌恶性生物学行为的影响及其相关机制，为卵巢癌的诊断及基因靶向治疗提供新的理论依据。 方法: 第一部分:1、利用生物信息学分析NDUFC1在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达差异;2、收集中国医科大学附属盛京医院行手术的原发性上皮性卵巢癌患者79例及因其他妇科良性疾病行卵巢切除的23例正常卵巢组织，应用免疫组化方法，检测NDUFC1在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达差异;3、应用免疫组化方法对卵巢癌组织芯片检测，研究NDUFC1表达水平与患者临床病理信息的相关性，并应用Kaplan-Meier分析卵巢癌患者NDUFC1的表达水平与预后的相关性。 第二部分:1、应用qRT-PCR检测卵巢癌细胞株及正常卵巢细胞株中NDUFC1的mRNA表达差异;2、通过敲减NDUFC1慢病毒感染卵巢癌细胞系A2780、HO-8910,应用qRT-PCR及Western Blot验证敲减率;3、通过Celigo细胞计数探究敲减NDUFC1对卵巢癌细胞增殖的影响，应用Annexin Ⅴ-APC单染法检测敲减NDUFC1对卵巢癌细胞凋亡的影响，通过流式细胞术，检测敲减NDUFC1对细胞周期的调控;细胞划痕实验、Transwell实验检测对卵巢癌细胞迁移浸润能力的影响。4、构建敲减NDUFC1的卵巢癌细胞裸鼠成瘤模型，体内实验进一步验证NDUFC1对卵巢癌细胞成瘤能力的影响。5、利用Western Blot验证差异表达NDUFC1,对NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的影响;6、对过表达NDUFC1细胞加入NF-κB信号通路抑制剂NF-κB-IN-1,利用Western Blot 检测 NF-κB信号通路相关蛋白的表达，利用CCK8实验及Annexin Ⅴ-APC单染法，检测过表达NDUFC1及加入NF-κB信号通路抑制剂后对细胞增殖、凋亡能力的影响。 第三部分:1、应用TMT蛋白组学筛出受NDUFC1调控的潜在分子靶标，选取差异表达显著的PIR、CLU、TLE1做后续筛选;2、应用qRT-PCR及 Western Blot验证敲减NDUFC1后PIR、CLU、TLE1的表达;3、通过Co-IP实验进一步证实了NDUFC1与PIR蛋白相互作用;4、构建过表达NDUFC1、敲减PIR、过表达并敲减PIR的稳转细胞株，通过CCK-8实验、流式双染细胞凋亡实验及Western Blot检测对卵巢癌细胞增殖、凋亡及下游NF-κB信号通路的影响。 结果: 第一部分:1、根据TCGA、GTEx数据库及GEO数据库中数据集GSE66957的数据分析，卵巢癌组织中NDUFC1 mRNA的表达水平相对于正常卵巢组织显著上调;2、免疫组化结果显示NDUFC1在卵巢癌组织中的表达显著高于正常卵巢组织中的表达，且NDUFC1的表达与病理分级、肿瘤浸润范围、FIGO临床分期及是否复发病理资料呈正相关;3、Kaplan-Meier生存分析结果显示，NDUFC1的表达升高与卵巢癌患者的总生存期和无病生存期缩短显著相关。 第二部分:1、成功构建了两株敲减NDUFC1的卵巢癌细胞系A2780及HO-8910,并进行进一步的表型验证，Celigo细胞计数实验显示，敲减NDUFC1后抑制了卵巢癌细胞的增殖能力。细胞凋亡实验结果表明敲减NDUFC1增加了卵巢癌细胞的凋亡能力。细胞周期实验结果显示敲减NDUFC1影响卵巢癌细胞的细胞周期并将细胞周期阻滞于G2期;细胞划痕实验、Transwell实验证明敲减NDUFC1抑制了卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力;2、通过裸鼠成瘤实验发现，敲减NDUFC1抑制了肿瘤在裸鼠体内的生长;3、Western Blot结果显示，敲减NDUFC1后，NF-κB通路相关蛋白p-P50,p-P65(S536),p-IKBα表达下调。过表达NDUFC1后，NF-κB通路相关蛋白p-P50、p-P65、p-IKBα表达上调;4、在对过表达NDUFC1细胞加入NF-κB通路抑制剂NF-κB-IN-1后，能反转过表达NDUFC1对卵巢癌细胞增殖、凋亡的作用。 第三部分:1、TMT蛋白组学结果显示敲减NDUFC1后差异表达蛋白总数570个，其中331个蛋白上调，239个蛋白下调，选取差异表达显著的PIR、CLU、TLE1做后续筛选;2、qRT-PCR结果显示，敲减NDUFC1后PIR表达显著降低，CLU、TLE1表达显著升高;3、Western blot结果显示敲减NDUFC1后PIR、CLU、TLE1表达显著下调;4、Co-IP实验验证NDUFC1与PIR相互结合;5、CCK-8实验证明过表达NDUFC1促进细胞增殖，敲减PIR抑制细胞增殖，并且敲减PIR能够逆转过表达NDUFC1对卵巢癌细胞增殖的影响;6、凋亡实验证明过表达NDUFC1抑制细胞凋亡，敲减PIR促进细胞凋亡，并且敲减PIR能够逆转过表达NDUFC1对卵巢癌细胞凋亡的影响;7、Western blot实验证明敲减PIR,NF-κB通路相关蛋白p-P50,p-P65,p-IKBα表达下调，并且敲减PIR能够逆转过表达NDUFC1对NF-κB通路的作用。 结论: 1、NDUFC1参与了卵巢癌的发生发展，高表达NDUFC1与其不良预后相关;2、NDUFC1促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤的体内生长，并抑制凋亡，影响卵巢癌细胞周期。3、NDUFC1通过调控PIR激活NF-κB通路影响卵巢癌的增殖与凋亡。
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