摘要
产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)是一种食源性致病菌，能够触发全球范围内的人畜共患疾病暴发。在感染性疾病的病原体构成中，它占据了重要的位置，并且能够引发人类各种严重程度的疾病，有时甚至可能导致死亡。前期对新疆牛源非O157 STEC H34菌株作用于人肠道上皮细胞(Human intestinal epithelial cell,HIEC)的致病机制有了初步研究，但仍然缺乏更全面深入的分子水平探究。因此本研究利用转录组测序技术解析STEC感染HIEC细胞后的转录组学变化，筛选炎症和细胞凋亡相关的mRNA、miRNA和lncRNA,为更进一步的研究STEC感染HIEC细胞通路的分子机制提供新的理论依据。主要研究内容和结果如下: 1.通过STEC感染HIEC细胞设置感染组和对照组，对两组各3个平行样本进行全转录组测序。通过生物信息学分析，本试验鉴定到1462个mRNA基因发生差异表达变化。其中有703个mRNA基因表达上调，759个mRNA基因表达下调。通过对差异表达mRNA基因进行功能注释分析，发现其主要集中在与炎症反应和细胞凋亡相关的Hippo信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路和Jak-STAT信号通路。而且参与炎症反应的TNF和IL-6基因表达呈现显著上调,提示STEC感染HIEC细胞会引起严重的炎症反应。除此之外，介导细胞凋亡的TRADD基因表达呈现显著下调，提示STEC感染会影响HIEC细胞凋亡过程。 2.通过对感染组和对照组进行small RNA转录组测序，分析HIEC细胞在STEC感染后差异表达的miRNA,共鉴定到19个miRNAs显著差异表达，其中上调表达的miRNAs有8个，下调表达的有11个。19个差异表达miRNAs共靶向结合到11 271个mRNAs,靶基因主要富集在炎症反应以及细胞凋亡相关过程。Hsa-miR-675-5p是表达量最高且显著上调表达的miRNA,使用双荧光素酶报告基因实验验证了其可以与促凋亡基因FADD直接靶向结合，又通过qRT-PCR和Western blot实验证实了 hsa-miR-675-5p能够负性靶向调控FADD基因，表明hsa-miR-675-5p可能成为关键靶点。 3.为更深入地了解lncRNA在STEC感染HIEC中的调控作用，对全转录组测序中lncRNA表达谱进行分析，共鉴定了 53 792个lncRNAs,有48 333个已知的lncRNAs和5 459个新的lncRNAs。共有702个lncRNAs差异表达，其中有416个lncRNAs表达上调，286个lncRNAs表达下调。通过对lncRNA顺式调控作用的预测，发现差异表达lncRNA的顺式靶基因在粘附连接和内吞途径中高度富集。而基于mRNA-miRNA-lncRNA互作网络分析，有17个差异表达的lncRNAs靶向调控hsa-miR-543参与TRADD、TRAF1和TGFB2的表达水平变化，影响STEC感染HIEC细胞过程中的炎症反应和细胞凋亡，这些调节过程可能导致肠道病变。 综上所述，本研究对STEC感染的HIEC进行全转录组测序，1462个mRNAs、19个miRNAs和702个lncRNAs显示差异性表达，并在与炎症反应和细胞凋亡相关的信号通路中发挥作用。实验发现hsa-miR-675-5p能够下调FADD的表达，进而参与调控细胞凋亡过程，表明其可能作为STEC感染的一个潜在生物标志物。此外，对lncRNA顺式调控靶基因的功能预测显示其主要在与炎症相关的过程显著富集。基于mRNA-miRNA-lncRNA互作网络分析，发现17个差异表达的lncRNAs靶向hsa-miR-543进而参与TRADD、TRAF1和TGFB2基因的调控。本试验从更深入的分子水平方面探究了STEC感染后的肠道细胞变化，并预测了 STEC感染HIEC过程中非编码RNA可能发挥的作用，对未来研发预防和治疗STEC疾病的药物提供了新的方向和理论数据支持。
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