摘要
单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA binding protein,SSB)广泛分布于三域生物中，在DNA复制、重组和损伤修复等过程中起重要作用。真核生物的单链DNA结合蛋白RPA(Replication protein A)为异源三聚体，共有6个OB-fold(oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold);细菌中的SSB通常是同源的四聚体，其单体由一个N端的OB-fold和疏水性的C端组成。古菌中的SSB呈现多样性，既有与真核生物RPA类似的多OB-fold异源三聚体，也有更接近细菌的单OB-fold SSB;然而在一些热变形菌目古菌中缺乏编码含有OB-fold的SSB,取而代之的是被视为非经典SSB(non-canonical SSB)的ThermoDBP。 硫磺矿硫化叶菌(Saccharolobus solfataricus)中经典SSB和细菌的组成相似，由一个N端的OB-fold和疏松的C端组成，但其OB-fold的结构却更接近于真核生物的DBD-B。SsoSSB表现出与真核RPA和细菌SSB不同的特性:SsoSSB以单体形式结合ssDNA;SsoSSB在体外对ssDNA和ssRNA具有相同的高亲和性，这一点明显区别于真核RPA和细菌SSB;真核RPA和细菌SSB与众多的DNA复制蛋白互作，而SsoSSB仅发现与DNA复制的解旋酶MCM(mini-chromosome maintenance)互作;在嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)中，SacSSB可以被敲除;这些不同寻常的特征，也暗示着硫化叶菌SSB可能与其他经典SSB有不同的功能。在冰岛硫化叶菌(Saccharolobus islandicus)REY15A中，同时存在含有OB-fold的经典SSB(SisSSB)和不含OB-fold的ThermoDBP同源蛋白SisDBP。SisSSB是否必需，SisDBP能否替补SisSSB的功能，或者两者之间是否存在功能上的联系是未知的。 本研究中，我们使用CRISPR-Cas的基因编辑方法，在S.islandicus REY15A中对已知的两个单链DNA结合蛋白SisSSB和SisDBP的编码基因sire_0161和sire_1003进行敲除，得到单敲菌株△ssb和△dbp以及双敲菌株△dbp△ssb，说明两个单链DNA结合蛋白对于硫化叶菌来说都不是必需的。敲除菌株的生长速度、细胞周期和DNA复制都没有受到影响。对DNA损伤剂4-NQO、HU、MMS和Cisplatin的敏感性没有增加，DNA损伤也可以被修复。然而，△ssb在DNA损伤响应时反应更强烈:细胞聚集出现得更早、结束更晚，细胞聚集度更大。转录组分析发现，SisSSB缺失之后有44个基因上调和18个基因下调，其中16个上调的基因与以Orc1-2为中心的DNA损伤应答相关，我们推测SisSSB的缺失导致了细胞内的DNA更容易出现损伤，从而在NQO处理后DNA损伤应答反应更加迅速;而SisDBP的缺失菌株只有个别的基因转录发生变化，这些基因与DNA代谢无关。而且，SisSSB与SisDBP两者之一的缺失并未造成另一个蛋白在转录或蛋白水平的上调。使用生物素标记的ssDNA从细胞裂解液中获取ssDNA的互作蛋白，野生型菌株E233S的ssDNA互作蛋白中，SisSSB占据了绝对的主导地位，之后是SiRe_2062和SiRe_1772;在△ssb菌株中，SisSSB的缺失致使更多的SisDBP结合在ssDNA上，然而SisDBP远未达到SisSSB的丰度;在双敲菌株△dbp△ssb的ssDNA互作蛋白中，SiRe_2062和SiRe_1772位列前两位，但都达不到SisSSB的丰度。这说明在野生型S.islandicus中，SisSSB是结合ssDNA的主要蛋白，而SisSSB缺失之后，没有蛋白替代其ssDNA结合的功能。 将E233S基因组上Sisssb的天然启动子替换为诱导型的阿拉伯糖启动子，得到菌株Para∷ssb。Para∷ssb菌株在蔗糖培养基中SisSSB的蛋白水平约为E233S的1/3。在D-阿拉伯糖培养基中,SisSSB的蛋白水平是E233S的2.11倍，达到了过表达的效果，过表达SisSSB造成细胞生长迟滞，细胞周期整体拉长到原来的2倍左右，不单单是影响了DNA复制过程。 SisSSB的敲除和敲低菌株在较低温度65℃、60℃和55℃下表现出了明显的生长抑制，随着温度降低生长迟滞越明显。然而，基因组测序显示，SisSSB基因敲除菌株没有产生更多突变，低温下SisSSB的缺失也没有造成更多的细胞死亡。这样的生长迟滞与细菌的冷休克蛋白(Cold shock protein，Csp)的缺失表型非常相似。我们检测到了E233S菌株中SisSSB在55℃时蛋白水平是75℃的1.8倍左右，且SisSSB具有典型的RNA伴侣活性:SisSSB在大肠杆菌RL211中表现出抗转录终止活性，可以打开trpL终止子的RNA发卡结构从而使下游的报告基因表达。在体外，SisSSB可以解开dsRNA。此外，SisSSB的核心结构域(OB-fold结构域)可以有效地回补大肠杆菌Csp缺失菌株BX04在的低温敏感表型。我们推测SisSSB可以消除BX04菌株在低温下的RNA二级结构，从而回补其低温敏感表型。基于此特点，我们认为S.islandicus需要SisSSB来消除低温引起的RNA二级结构。 序列比对结果显示，古菌中的单OB-fold SSB可分为SSB1、SSB2和SSB3三类，SisSSB属于SSB1类型。我们挑选了来自S.acidocaldarius、Acidianus hospitalis,Staphylothermus hellenicus、Thermogladius calderae、Candidatus Korarchaeota和Candidatus Heimdallarchaeota的SSB1类型的SSB进行研究，以大肠杆菌SSB作为对照。EMSA实验显示重组表达和纯化的SacSSB、AhoSSB、SheSSB和TcaSSB对ssDNA和ssRNA的亲和力是一样的，而KorSSB、HemidallSSB以及EcoSSB结合ssDNA的能力要高于ssRNA。并且SacSSB、AhoSSB、SheSSB和TcaSSB的核心结构域也可以回补BX04菌株的低温敏感表型，而KorSSB、HemidallSSB和EcoSSB则不能。我们进一步分析了SSB和Csp在古菌中的分布，发现可以回补BX04低温敏感的SisSSB、SacSSB、AhoSSB、SheSSB和TcaSSB,它们的来源菌中都没有细菌Csp同源蛋白的存在，而KorSSB、HemidallSSB和EcoSSB的来源菌中都可以比对到细菌Csp的同源蛋白。我们推测，在缺乏细菌Csp同源蛋白的古菌中，SSB作为RNA分子伴侣行使Csp的功能，消除细胞中因温度下降产生的RNA二级结构，从而使细胞适应环境的温度变化。 本研究通过遗传、组学分析以及体外生化实验，证明了S.islandicus中经典SSB不是DNA复制和修复所必需的，而在低温下RNA结构的维持、对环境温度降低的适应中发挥重要作用。并通过实验和系统发育分析，提出在缺乏Csp的古菌中，其SSB1类型的SSB可以起到Csp的作用，帮助细胞适应低温环境。
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