摘要
目的: 研究EphB3在胶质母细胞瘤侵袭、迁移及增殖中的作用，明确其在胶质母细胞瘤中的作用机制，探讨EphB3作为胶质母细胞瘤的潜在诊断和治疗靶点的价值。 方法: 本课题通过慢病毒构建U87MG、U251细胞系EphB3过表达模型，利用shRNA下调U87MG、U251细胞系EphB3的 表达。qPCR 验证Ⅰ级—Ⅳ级胶质瘤中EphB3的mRNA表达情况。收集80例胶质瘤标本进行免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)验证 不同级胶质瘤 组织中EphB3蛋白表达情况。利用蛋白质印记技术(Western Blotting,WB)验证Ⅰ级—Ⅳ级胶质瘤及不同细胞系的EphB3表达及通路下游相关蛋白表达情况。划痕实验及Transwell来验证EphB3对U87MG、U251细胞系 侵袭、迁移的影响。细胞增殖实验(Cell Counting Kit-8，CCK-8)验证 EphB3对U87MG、U251细胞系增殖能力的影响。通过 U87MG裸鼠原位成瘤实验、颅内活体成像实验、H&E染色及IHC实验验证EphB3对肿瘤成瘤能力、侵袭范围、裸鼠生存时间、下游蛋白表达情况的影响及其可能的作用机制。 结果: qPCR实验表明:相对于低级别胶质瘤，高级别胶质瘤的EphB3 mRNA表达较低(P＜0.05)。WB及IHC实验表明:相对于低级别胶质瘤，高级别胶质瘤EphB3表达较低（P＜0.05）。WB实验结果表明:与正常人星形胶质细胞（Normal human astrocytes，NHA）相比，U87MG、U251的EphB3表达较低（P＜0.05）。构建U87MG、U251细胞系慢病毒过表达EphB3稳转株，通过WB、划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验发现:EphB3过表达后细胞的侵袭、迁移及增殖能力较对照组明显减弱（P＜0.05）。同时，通过shRNA对U87MG、U251细胞系下调EphB3的表达，通过WB、划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验发现:当EphB3敲低后细胞的侵袭、迁移及增殖较对照组明显增加（P＜0.05）。接下来，为了验证EphB3是否能通过EGFR-PI3K/AKT细胞通路影响U87MG、U251细胞系的侵袭、迁移及增殖。shRNA下调EphB3表达后再使用PI3K（LY294002）抑制剂及AKT（MK-2206）抑制剂抑制p-PI3K和p-AKT表达。当p-PI3K、p-AKT被抑制后通过WB证明，下调EphB3之后，EGFR、p-PI3K、p-AKT表达上调，p-PI3K被抑制后，上游的EGFR表达不变，下游p-AKT蛋白表达降低，p-AKT抑制后，上游的EGFR、p-PI3K表达不变。当p-PI3K、p-AKT被抑制后通过划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验发现U87MG、U251细胞的侵袭、迁移、增殖较未添加抑制剂组明显减少（P＜0.05）。在动物实验方面，使用裸鼠颅内原位种植肿瘤。通过小动物活体成像检测颅内肿瘤第0、14、28天的荧光信号发现EphB3对照组肿瘤信号比过表达组强。在第28天，对所有裸鼠进行取材后进行H&E染色及IHC分析，H&E染色结果表明EphB3对照组的肿瘤体积较EphB3过表达增大。IHC结果表明，EphB3过表达时EGFR、p-PI3K、p-AKT表达表达较低。而对第二批颅内原位种植瘤进行生存分析EphB3对照组的生存时间较EphB3过表达组明显缩短（P＜0.01）。最后检测16例Ⅳ级胶质瘤EphB3的蛋白表达，根据EphB3蛋白表达情况分为EphB3高表达组和低表达组，通过IHC分析下游基因蛋白的表达。EphB3低表达组的下游基因EGFR、p-PI3K、p-AKT较EphB3高表达组的明显增高。 结论: （1）EphB3表达水平越低，胶质瘤的恶性程度越高。 （2）EphB3过表达可抑制胶质母细胞瘤的侵袭、迁移、增殖。 (3)EphB3调节EGFR-PI3K/AKT信号通路并抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭、迁移、增殖。
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