摘要
病原微生物给水产领域及其相关产业造成了极大的危害，寻找精准、快速和高灵敏的微生物诊断方法对于生物安全、公共卫生和环境监测等领域具有重要意义。传统微生物诊断方法因检测时间长、仪器昂贵和假阳性等问题，无法满足临床诊断的需求。近年来，具有高特异性切割核酸的CRISPR-Cas系统备受关注，其中CRISPR-Cas12系统属于CRISPR-Cas系统的Ⅱ类，它具有特异性/非特异性切割不同类型核酸的活性，已成为核酸诊断技术的研究热点。本论文分别利用CRISPR-Un1Cas12f1系统和CRISPR-LbCas12a系统的核酸切割性质，结合体外扩增技术、核酸适配体技术构建了三种高特异性、高灵敏度、高准确性的诊断微生物方法，为临床诊断微生物提供了新的方法选择。具体研究内容如下: 1.基于RNA激活的CRISPR-Un1Cas12f1系统诊断微生物。本研究首次发现RNA激活CRISPR-Un1Cas12f1系统，触发其非特异性切割单链DNA的活性，但不能特异性切割RNA。同时靶标RNA的序列长度会影响CRISPR-Un1Cas12f1系统切割活性;靶标RNA 3''端的碱基缺失会严重抑制CRISPR-Un1Cas12f1系统的切割活性;此外，CRISPR-Un1Cas12f1系统具有识别靶标RNA单碱基错配的能力。基于以上研究结果，结合RT-PCR扩增和RNA体外转录技术，开发出高灵敏度和高特异性检测伤寒沙门氏菌的方法(ATCas-RNA)，该方法检测核酸的灵敏度为1 aM，实现了 100％的样品诊断准确率。ATCas-RNA方法拓宽了CRISPR-Cas12系统在诊断技术领域的应用，具有作为临床诊断的潜力。 2.基于核酸适配体的CRISPR-Un1Cas12f1系统诊断微生物。针对微生物诊断依赖核酸提取或核酸扩增的问题，开发了一种基于核酸适配体的CRISPR-Un1Cas12f1生物传感器(ACasB)。该方法对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的检测展现出高特异性、高灵敏性、无需核酸提取及核酸扩增的优点。具体为，金黄色葡萄球菌的特异性核酸适配体与阻滞剂(Blocker)进行碱基互补配对形成杂交寡核苷酸链(Hy-dsDNA)。当金黄色葡萄球菌侵染时，Hy-dsDNA发生解离并释放出Blocker。Blocker作为Un1Cas12f1/sgRNA复合物的激活剂，引发Un1Cas12f1/sgRNA复合物切割荧光探针(ssDNA-FQ)并产生荧光信号，ACasB生物传感器诊断金黄色葡萄球菌的灵敏度为400 CFU/mL。与qPCR相比，ACasB生物传感器可以直接在血液样品中检出金黄色葡萄球菌，实现了金黄色葡萄球菌的现场检测。 3.基于体外扩增的CRISPR-LbCas12a自驱动催化系统诊断微生物。针对灵敏度和便捷性的需求，开发出CRISPR-Cas12a系统自驱动催化体系。相较于CRISPR-Cas12a系统直接诊断靶标，该诊断体系灵敏度提高了 4个数量级(1 fM);结合体外扩增技术，开发出超灵敏、精准诊断伤寒沙门氏菌的方法(SfCas-P),其诊断灵敏度达到了 1CFU/mL。SfCas-P诊断方法具有应用于实际环境诊断的潜力，为微生物诊断提供了新选择。
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