摘要
母乳低聚糖(Human mike oligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，其对婴幼儿的生长发育具有重要的生理意义。目前，已经有超过200种HMOs被鉴定出来，它们对婴幼儿的健康与发育都有着深远影响。牛乳中的低聚糖与HMOs结构较为相似，被认为是最佳的母乳替代原，目前已经鉴定出至少60种以上牛乳低聚糖(Bovine mike oligosaccharides,BMOs),由于牛奶产量庞大，BMOs种类较为丰富，这使得BMOs作为更健康的低聚糖来源成为可能。目前对我国不同品种牛奶中的主要低聚糖含量的报道非常少。本论文一方面将对来自北京牧场和河北牧场的荷斯坦牛、娟姗牛、三河牛、蜀宣花牛、新疆褐牛和西门塔尔牛等7个品种/地区的牛乳中10种低聚糖包括2''FL、3''岩藻糖基化乳糖(3''Fucosylated lactose,3''FL)、二唾液酸乳糖(Disialate lactose，DSL)、乳-N-岩藻五糖 Ⅰ((Lacto-N-fucopentaose Ⅰ,LNFP Ⅰ)、3’唾液酸乳糖(3''Sialylated lactose,3''SL)、乳糖-N-四糖(Lactose-N-tetrasaccharide，LNT)、3''半乳糖基乳糖(3''galactose,3''GL)、LNnT、6''唾液酸-N-乙酰乳糖胺(6''Sialate-N-acetyllactosamine,6''SLN)、6’唾液酸乳糖(6''Sialylated lactose,6''SL)进行定量测定，为BMOs的规模化生产提供数据基础;另外一方面将检测几种有一定应用基础的低聚糖，如2''FL、3''SL、LNT、低聚果糖(Fructooligosaccharides，FOS)和总BMOs对肠道细胞增殖发育的影响,为BMOs未来的应用提供一定的理论基础。本论文的主要研究结果如下: (1)通过高效液相色谱串联紫外检测器对牛乳中2''FL、3''SL、3FL、LNT、LNnT、3''GL、6''SLN、6''SL、DSL和LNFP I10种低聚糖进行分离检测，确定了检测方法:①流动相A为乙腈，流动相B为甲酸铵(pH=4.4)。②梯度洗脱条件为:0～89min,流速为 0.5 ml/min;89～99.5 min，流速为 0.4 ml/min。0～2.3 min，95％A;2.3～4.9min,95～90％A;4.9～32 min,90～82％A;32～48 min,82～80％A;48～61 min,80～78％A,61～89 min,78～74.6％A;89～92 min,74.6～30％A;92～98 min,30～90％A;98～99.5 min,90～95％A。③各低聚糖的保留时间为:2''FL:39 min;DSL:41.1 min;3FL:44.91 min;LNFP Ⅰ:45.86 min;3''SL:53.61 min;LNT:63.22 min;3''GL:72.799 min;LNnT:80.384 min;6''SLN:85.592 min;6''SL:91.7 min。 (2)分别对98头北京牧场的荷斯坦牛、293头河北牧场的荷斯坦牛、98头娟姗牛、19头四川蜀宣花牛、73头内蒙古三河牛、83头新疆褐牛和75头西门塔尔牛的牛乳进行10种低聚糖含量检测。 (3)检测了不同浓度梯度的5种低聚糖(FOS、2''FL、3''SL、LNT和BMOs)对Caco-2细胞的增殖和分化作用。实验发现，0.001 mg/mL、0.01 mg/mL和0.1 mg/mL的FOS、2''FL、3''SL和LNT处理Caco-2细胞1d和2d时，对于细胞增殖的促进作用并不明显;但处理3 d时，4种低聚糖均能显著促进细胞的增殖;BMOs处理Caco-2细胞1 d、2 d和3 d，对于细胞的增殖均具有显著促进作用，分别提高了 58％、49.38％和70.7％。在基因表达量上，0.1mg/mL的FOS、2''FL、3''SL、LNT以及BMOs处理Caco-2细胞 3 d 时，BMOs、FOS 和 LNT 均显著上调 Cyclin A;2''FL 显著上调 Cyclin D2;3''SL显著上调 Cyclin A 和 Cyclin D1。0.01 mg/mL_FOS、2''FL、3''SL 和 LNT 对于细胞分化具有不同程度的抑制作用，相对于DMEM处理，FOS、2''FL、3''SL和LNT处理的碱性磷酸酶活性分别降低了 31.32％、24.97％、59.64％和29.63％。但BMOs能够促进细胞分化，相对于对照组，BMOs处理的碱性磷酸酶活性提高了 12.87％。 (4)检测了不同浓度梯度的5种低聚糖(FOS、2''FL、3''SL、LNT和BMOs)对Caco-2的脂多糖损伤保护和肠屏障建立作用。实验发现，提前处理3d后，0.001 mg/mL和0.1 mg/mL的FOS对于脂多糖损伤的Caco-2细胞活性分别提高了 32.13％和30.33％;0.001 mg/mL、0.01 mg/mL和0.1 mg/mL的2''FL对于受损的Caco-2细胞活性分别提高了 58.37％、28.54％和 49.86％;0.001 mg/mL 和 0.01 mg/mL 的 3''SL 对于受损的 Caco-2细胞活性提高了 39.83％和55.18％;0.01 mg/mL和0.1 mg/mL的LNT对于受损的Caco-2细胞活性提高了 41.63％和55.88％;BMOs处理1d、2 d和3 d，对于受损的Caco-2细胞活性分别提高了 10.27％、43.43％和 15.47％。0.0 1mg/mLFOS、2''FL、3''SL、LNT以及BMOs对于肠屏障的建立都具有不同程度的抑制作用,相对于DMEM处理，FOS、2''FL、3''SL、LNT、BMOs 处理的 TEER 值降低了 26.05％、21.83％、65.55％、45.74％和 20.25％。
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