摘要
目的:骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种常见的全身骨代谢性疾病，容易发生骨折，已经引起广泛关注。近年来，大量研究表明miRNAs可以靶向调控成骨分化相关的基因和信号通路，进而参与成骨分化过程。因此，本研究拟探讨miR-148a-3p在调控MC3T3-E1细胞成骨分化及骨质疏松骨重塑中的作用，并进一步明确miR-148a-3p/p300/Nrf2这一潜在的调控轴在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用机制，为骨质疏松症的预防和治疗提供新的潜在靶点。 方法:本研究主要从细胞实验与动物实验探讨miR-148a-3p通过调控p300的表达影响MC3T3-E1细胞成骨分化及骨质疏松骨重塑。 一 细胞实验 1.成骨诱导培养MC3T3-E1细胞，qRT-PCR及Western blot检测成骨诱导1d、3d、5d、7d 细胞内 miR-148a-3p、p300、Nrf2、Runx2、osteocalcin 及 Col1a1 的表达情况。 2.在MC3T3-E1细胞中转染miR-148a-3p inhibitor质粒，qRT-PCR检测各组细胞 miR-148a-3p、Runx2、osteocalcin 及 Col1a1 的表达情况;CCK-8 检测各组细胞的增殖能力;ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测各组细胞ALP活性，矿化及钙化结节数量，Western blot检测各组细胞Runx2、osteocalcin及Col1a1的蛋白表达情况。 3.通过双荧光素酶报告基因检测判断miR-148a-3p与p300的调控关系;分别过表达和下调MC3T3-E1细胞中miR-148a-3p的表达水平，利用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞p300的表达情况;进一步过表达MC3T3-E1细胞中p300基因，qRT-PCR和 Western blot检测各组细胞p300的表达情况;在MC3T3-E1细胞中，单独过表达miR-148a-3p或同时过表达miR-148a-3p与p300,qRT-PCR检测各组细胞miR-148a-3p、p300、Runx2、osteocalcin 及 Col1a1的表达情况，CCK-8 检测各组细胞的增殖能力，ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测各组细胞ALP活性，矿化及钙化结节数量，Western blot检测各组细胞Runx2、osteocalcin及Col1a1的蛋白表达情况。 4.双荧光素酶报告基因检测判断p300与Nrf2基因的结合与调控关系;ChIP实验检测Nrf2基因启动子区域内p300的富集情况;在MC3T3-E1细胞中，单独过表达miR-148a-3p 或同时过表达 miR-148a-3p 和 p300,Western blot 检测各组细胞 Nrf2、p65的蛋白表达情况。 5.在MC3T3-E1细胞中转染Si-Nrf2质粒，qRT-PCR检测各组细胞Nrf2、Runx2、osteocalcin及Col1a1的表达情况;ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测各组细胞ALP活性，矿化及钙化结节数量，Western blot检测各组细胞Runx2、osteocalcin及Col1a1的蛋白表达情况。 二 动物实验 构建卵巢去势（ovariectomy，OVX）骨质疏松小鼠模型，将32只12周龄C57BL/6J雌性小鼠，随机分为4组，每组8只。分别为sham组（假手术）;OVX组（切除双侧卵巢，建立骨质疏松模型）;OVX+antagomir-NC组（切除双侧卵巢后，体外注射antagomir-NC慢病毒载体）;OVX+antagomiR-148a-3p组（切除双侧卵巢后，体外注射antagomiR-148a-3p慢病毒载体）。所有小鼠造模后饲养6周，取小鼠股骨进行Micro-CT检测各组骨组织骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁间距（Tb.Sp）;HE染色检测骨组织骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），qRT-PCR检测骨组织miR-148a-3p和 p300 的表达情况，Western blot 检测骨组织 p300、Runx2、Osteocalcin 及 Col1a1的蛋白表达情况。 结果:1.miR-148a-3p在成骨细胞分化过程中的表达水平逐渐下降，p300、Nrf2、Runx2、Osteocalcin和Col1a1的mRNA和蛋白表达量均逐渐上升。抑制miR-148a-3p的表达后，MC3T3-E1 细胞 Runx2、Osteocalcin、Col1a1 的表达量升高，CCK-8 检测，ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测结果均提示细胞增殖能力及成骨分化能力增强。 2.miRNA靶标基因预测网站显示p300可能是miR-148a-3p的下游靶基因，双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-148a-3p能够结合p300基因。过表达miR-148a-3p可抑制p300的表达情况，抑制miR-148a-3p的表达时p300的表达量显著上升。单独过表达miR-148a-3p时，细胞内Runx2、Osteocalcin及Col1a1的mRNA和蛋白表达明显下降;CCK-8检测，ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测结果提示细胞增殖能力及成骨分化能力明显降低，同时过表达miR-148a-3p和p300时，细胞内Runx2、Osteocalcin及Col1a1的mRNA和蛋白表达明显上升;CCK-8检测，ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测结果提示细胞增殖能力及成骨分化能力明显增强。 3.双荧光素酶报告基因检测结果显示p300能够与Nrf2启动子结合，且二者结合能力与p300的表达量呈正比;ChIP实验结果进一步证实，p300可以通过与Nrf2结合并影响其转录活性;Western blot结果显示:过表达miR-148a-3p可抑制Nrf2及p65的蛋白表达水平，而同时过表达miR-148a-3p和p300可部分逆转miR-148a-3p对Nrf2及p65的抑制作用;下调Nrf2的表达可降低Runx2、Osteocalcin、Col1a1的表达，同时ALP染色，ALP活性检测和ARS染色检测结果均提示细胞成骨分化能力降低。 4.与sham组小鼠相比，OVX小鼠Micro-CT检测结果显示小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N降低，Tb.Th变薄，Tb.Sp变小;骨组织HE染色结果显示骨小梁数目和厚度明显减少，模型成功;qRT-PCR检测结果显示骨组织内miR-148a-3p的表达显著升高，p300的表达显著下降，Western blot检测骨组织内成骨分化相关蛋白Runx2、Osteocalcin及Col1a1的表达显著减少。进一步抑制OVX小鼠体内miR-148a-3p的表达，Micro-CT检测结果显示小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N显著增加，Tb.Th明显变厚，Tb.Sp明显变小;骨组织HE染色结果显示骨小梁数目和厚度明显增加，qRT-PCR检测结果显示骨组织内miR-148a-3p的表达显著下降，p300的表达显著上升;Western blot检测骨组织内成骨分化相关蛋白Runx2、Osteocalcin及Col1a1的表达显著增加。 结论:1.成骨分化过程中，MC3T3-E1细胞中miR-148a-3p的表达逐渐下降，p300和Nrf2的表达逐渐上升;抑制miR-148a-3p的表达可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化。 2.miR-148a-3p能够结合p300,过表达miR-148a-3p可降低p300的表达进而抑制MC3T3-E1细胞成骨分化;过表达p300可逆转miR-148a-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用，表明miR-148a-3p通过调控p300的表达影响MC3T3-E1细胞的成骨分化。 3.p300可以与Nrf2结合并影响其转录活性;过表达miR-148a-3p可抑制MC3T3-E1细胞内Nrf2的表达，而过表达p300可逆转miR-148a-3p对Nrf2、p65的抑制作用，下调Nrf2的表达可以抑制MC3T3-E1细胞成骨分化，表明miR-148a-3p可以通过介导p300的表达影响Nrf2通路的激活，从而影响细胞成骨分化过程。 4.抑制OVX小鼠体内miR-148a-3p的表达，可显著提高p300的表达促进骨质疏松小鼠骨重塑。
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