摘要
目的: 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种以黏液性血便、腹部疼痛、腹泻为主要临床表现的慢性疾病，其病因尚不明确。课题组前期研究发现，甘草可通过调节免疫细胞平衡及肠道菌群稳态缓解UC。本课题拟通过体内实验观察甘草对UC小鼠氧化应激系统的调节作用及对线粒体自噬的影响，再通过小干扰核糖核酸(siRNA)的方法体外验证甘草缓解UC的分子机制，阐述甘草抗炎及维持氧化应激系统稳态的科学内涵，为临床治疗UC提供实验依据。 方法: 1.甘草对UC小鼠的治疗作用:3％葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium，DSS)自由饮一周建立UC小鼠模型，给予不同浓度甘草提取物一周，观察小鼠状态及体重变化;取材后记录小鼠结肠长度及HE检测结肠病理变化;记录小鼠胸腺和脾脏重量;酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平;透射电镜观察结肠组织细胞中线粒体形态;微板法检测小鼠结肠组织MDA含量及SOD、GSH-PX活性;流式细胞术检测小鼠结肠组织中ROS含量及线粒体膜电位;蛋白免疫印迹法检测小鼠结肠组织中Nrf2/PINK1信号通路及线粒体自噬相关蛋白LC3、P62的表达水平。 2.甘草促进线粒体自噬缓解Caco2细胞损伤:将Caco2细胞分为正常组、模型组(LPS,200ng/mL)、甘草含药血清低中高浓度组(5％、10％、20％)，线粒体自噬抑制剂组(Mdivi-1，20μmol/L),含药血清(20％)+Mdivi-1 组。给予 LPS(200 ng/mL)处理24h建立炎症模型，各组分别给于药物干预24 h。透射电镜观察各组线粒体形态;微板法检测MDA含量及SOD、GSH-PX活性;ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α水平;荧光倒置显微镜观察ROS含量及线粒体膜电位、Western blot 检测 ZO-1、Occludin、Nrf2、Keap1、HO-1、PINK1、Parkin 及自噬相关蛋白LC3、P62的表达水平。 3.甘草调控Nrf2/PINK1通路促进线粒体自噬:运用小干扰核糖核酸(siRNA)的方法观察Nrf2在线粒体自噬调控中的作用。RT-PCR筛选最佳转染序列，将干扰后的细胞分为空载体组(Negative control，NC)，Nrf2基因沉默组(Si-Nrf2)，含药血清(20％)+Si-Nrf2组，含药血清(20％)+NC组。微板法检测MDA、SOD、GSH-PX水平;ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α含量;荧光倒置显微镜观察并计算ROS含量及线粒体膜电位(MMP)、Western blot检测Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3 蛋白表达水平。 结果: 1.甘草可缓解UC小鼠便血情况，降低脾脏指数，升高体重，减轻结肠组织炎性细胞浸润等病理情况，抑制IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平，降低ROS、MDA含量，提高SOD、GSH-PX活性，缓解线粒体肿胀程度，促进自噬小体及自噬溶酶体的产生，提高Nrf2/PINK1通路及线粒体自噬相关蛋白的表达。 2.与正常组比较，LPS组Caco2细胞中线粒体数量减少，线粒体肿胀程度增加，线粒体脊结构紊乱;SOD、GSH-PX活性降低，MDA及ROS含量显著增高;IL-1β、IL-6及TNF-α水平上升，IL-10水平下降;MMP下降明显;Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3表达降低。与LPS组比较，甘草含药血清组SOD和GSH-PX活性显著升高，MDA及ROS含量显著降低;IL-1β、IL-6及TNF-α含量下降，IL-10水平升高;MMP 上升明显;Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3 表达水平上调。相比于Mdivi-1组，甘草含药血清(20％)+Mdivi-1组SOD和GSH-PX活性上升，MDA及ROS含量明显下降;IL-1β、IL-6及TNF-α水平降低，IL-10水平上升;MMP 显著上升;Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3 表达水平升高。 3.与NC组比较，Si-Nrf2组细胞中的MDA含量增加，SOD、GSH-PX活性降低;IL-1β、IL-6 及 TNF-α水平上升，IL-10 水平下降;Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3蛋白含量降低明显;与Si-Nrf2组比较，甘草含药血清干预后，细胞内MDA含量降低，SOD、GSH-PX活性提高;IL-1β、IL-6及TNF-α水平下降，IL-10 水平上升;Nrf2、PINK1、Keap1、HO-1、Parkin、P62、LC3 蛋白表达明显上调。 结论: 1.甘草可以降低UC小鼠的炎症因子和氧化应激水平，其机制可能是通过激活Nrf2/PINK1途径促进线粒体自噬。 2.甘草含药血清可通过促进线粒体自噬改善LPS诱导的Caco2细胞损伤。 3.甘草可激活Nrf2/PINK通路促进线粒体自噬改善LPS诱导的Caco2细胞损伤。
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