摘要
前言:胃癌是一种常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康。胃癌早期诊断率低且缺乏特异性，通常胃癌患者确诊时已处于中晚期。尽管目前可以采用手术、化疗、免疫治疗和靶向治疗等手段进行治疗，提高了部分胃癌患者的生存率。但是由于胃癌的发病机制复杂、异质性强，患者的治疗效果和整体预后目前仍不乐观，故迫切需要寻找新的辅助治疗方法提高临床疗效。 铁死亡是近年来新发现的一种铁依赖的调节性细胞死亡方式，由细胞膜上脂质过氧化的毒性累积而引发，其在形态学、遗传学和分子生物学上不同于凋亡、坏死以及其他类型的细胞死亡形式。越来越多的研究表明，铁死亡与多种人类疾病密切相关，且在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。因此诱导肿瘤细胞发生铁死亡可能代表一种抗肿瘤治疗的新策略，诱导肿瘤细胞发生铁死亡的药物或化合物也被认为是肿瘤治疗的潜在药物。Erastin是最常用的铁死亡诱导剂之一，通过抑制细胞对胱氨酸的摄取，导致GSH合成减少并引起细胞脂质过氧化，最终导致细胞发生铁死亡。一些研究表明，erastin可以诱导多种肿瘤细胞发生铁死亡，包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及胃癌细胞等。本课题组前期研究表明，erastin可以诱导胃癌细胞MGC803发生铁死亡，敲低GDF15可以促进erastin诱导的MGC803细胞铁死亡，但是erastin对胃癌细胞铁死亡影响的机制还有待深入研究。 S100A4又称PEL98、P9KA、FSP1等，是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一。许多研究表明，S100A4在多种人类恶性肿瘤中高表达，如胃癌、肺癌、前列腺癌和结直肠癌等，且与肿瘤转移及病人预后不良密切相关。许多研究也已证实S100A4影响胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和自噬等特性。由此可见，S100A4通过影响肿瘤细胞的相关生物学特性在胃癌等肿瘤的发生发展中发挥十分重要的作用，但是S100A4与肿瘤细胞铁死亡的关系目前尚未见报道。本课题组前期应用芯片技术分析了S100A4敲低后胃癌细胞MGC803中差异基因表达谱，我们发现其中部分差异基因与铁死亡有关，推测S100A4可能在胃癌细胞铁死亡调节中发挥重要作用。 为验证上述推测，我们拟开展相关实验研究。我们首先验证铁死亡诱导剂erastin可诱导胃癌细胞发生铁死亡，然后探究erastin对胃癌细胞中S100A4表达的影响，并观察转染S100A4表达载体对erastin诱导胃癌细胞铁死亡的影响;为进一步探究S100A4在胃癌细胞铁死亡中的作用，我们重点研究敲低S100A4联合低浓度erastin处理对胃癌细胞铁死亡的影响，在此基础上我们拟检测铁死亡相关指标lipid ROS、MDA的水平，以及调节铁死亡的抗氧化关键基因GPX4的表达，初步认识敲低S100A4联合低浓度erastin处理对胃癌细胞铁死亡影响的机制。本研究以胃癌为研究对象首次探讨了S100A4与细胞铁死亡的关系，希望通过本研究明确S100A4在erastin诱导胃癌细胞铁死亡中的作用，并初步认识其发挥作用的机制，为研发胃癌治疗的新策略提供理论依据和线索，对其他肿瘤的相关研究也将具有启示作用。 材料与方法: 1、实验材料:人胃癌细胞MGC803、人胃癌细胞HGC27。 2、实验方法: （1）细胞培养:5％CO2、37℃的恒温细胞培养箱培养人胃癌细胞MGC803、人胃癌细胞HGC27。 （2）细胞瞬时转染:在MGC803细胞中转染GV712-S100A4表达载体、S100A4-siRNA,HGC27细胞中转染S100A4-siRNA，用于后续实验。 （3）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）:检测MGC803和HGC27细胞中S100A4以及MGC803细胞中GPX4的mRNA表达水平。 （4）免疫印迹（WB）:检测MGC803和HGC27细胞中S100A4以及MGC803细胞中GPX4的蛋白表达水平。 （5）CCK8实验:检测MGC803细胞和HGC27细胞活力。 （6）流式细胞术:检测MGC803细胞和HGC27细胞中脂质活性氧含量。 （7）丙二醛（MDA）检测实验:检测MGC803细胞和HGC27细胞中丙二醛含量。 （8）透射电子显微镜:观察细胞线粒体的形态。 结果: 1、Erastin处理对胃癌细胞MGC803和HGC27铁死亡的影响 （1）Erastin对MGC803细胞铁死亡的影响:CCK8结果显示，erastin以剂量依赖性方式诱导MGC803细胞死亡（P＜0.05），铁死亡抑制剂ferrostatin-1或liproxstatin-1可挽救erastin诱导的细胞死亡（P＜0.05）;透射电子显微镜结果显示，MGC803细胞中erastin处理组线粒体形态发生改变，线粒体体积变小，嵴减少甚至消失。 （2）Erastin对HGC27细胞铁死亡的影响:CCK8结果显示，erastin以剂量依赖性方式诱导HGC27细胞死亡（P＜0.05）,铁死亡抑制剂ferrostatin-1或liproxstatin-1可挽救erastin诱导的细胞死亡（P＜0.05）。 2、Erastin处理对胃癌细胞中S100A4表达的影响 qRT-PCR及WB结果显示，erastin可以下调胃癌细胞MGC803和HGC27中S100A4mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05）。 3、过表达S100A4对erastin诱导胃癌细胞MGC803铁死亡的影响 （1）WB结果显示，过表达S100A4可以回复erastin处理所致的S100A4蛋白表达降低（P＜0.05）。 （2）CCK8实验结果显示，过表达S100A4可以挽救erastin处理引起的MGC803细胞活力降低（P＜0.05）。 4、敲低S100A4对erastin诱导胃癌细胞铁死亡的影响 （1）敲低S100A4对erastin诱导MGC803细胞铁死亡的影响:CCK8结果显示，在处理24h的时间点，浓度为10μM、20μM和25μM的erastin本身即可显著抑制细胞活力，联合敲低S100A4可进一步抑制细胞活力（P＜0.05）;在处理48h的时间点，2.5μM和5μM的erastin本身对细胞活力无显著影响，而联合敲低S100A4可显著抑制细胞活力（P＜0.05）。铁死亡抑制剂ferrostatin-1或liproxstatin-1可以挽救敲低S100A4联合低浓度erastin（2.5μM）处理所致的MGC803细胞活力降低（P＜0.05）。透射电子显微镜结果显示，MGC803细胞中敲低S100A4联合低浓度erastin处理组线粒体形态受损严重。 （2）敲低S100A4对erastin诱导HGC27细胞铁死亡的影响:CCK8结果显示，处理24h时，2.5μM和5μM的erastin本身即可显著抑制细胞活力，联合敲低S100A4可进一步抑制细胞活力（P＜0.05）;浓度为1μM的erastin本身对细胞活力无显著影响，而联合敲低S100A4可显著抑制细胞活力（P＜0.05）。铁死亡抑制剂ferrostatin-1或liproxstatin-1可以挽救敲低S100A4联合低浓度erastin（1μM）处理所致的HGC27细胞活力降低（P＜0.05）。 5、敲低S100A4联合低浓度erastin对胃癌细胞铁死亡影响的机制初步研究 （1）流式细胞术结果显示，敲低S100A4联合低浓度erastin处理可以显著增加胃癌细胞MGC803和HGC27中lipid ROS含量（P＜0.05）。 （2）丙二醛检测结果显示，敲低S100A4联合低浓度erastin处理可以显著增加胃癌细胞MGC803和HGC27中丙二醛含量（P＜0.05）。 （3）qRT-PCR及WB结果显示，敲低S100A4联合低浓度erastin处理可以显著抑制胃癌细胞MGC803中GPX4的mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05） 结论: 1、S100A4表达下调可介导erastin诱导的胃癌细胞铁死亡。 2、敲低S100A4表达可以增加erastin诱导胃癌细胞铁死亡的敏感性。 3、低浓度erastin处理条件下敲低S100A4可能通过抑制GPX4表达而促进胃癌细胞MGC803铁死亡。
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