摘要
干扰素-γ（Interferon-gamma,简称IFN-γ）是Ⅱ型干扰素的唯一成员，是一种具有广谱抗病毒作用的糖蛋白，还具有高效免疫调节、治疗癌症等作用。有研究表明减毒鼠伤寒沙门氏菌等兼性厌氧细菌靶向肿瘤并在内积累增殖后，肿瘤周围浸润大量中性粒细胞，引起了肿瘤治疗效果复发转移，预后效果不佳。有文献报道减毒鼠伤寒沙门氏菌和IFN-γ治疗肿瘤分别有抗肿瘤效果，但其联合治疗效果机理目前还未有相关报道。因此，本试验从减毒鼠伤寒沙门氏菌抗癌症和IFN-γ的免疫调节联合作用机制角度入手。探究其联合治疗对免疫细胞及肿瘤治疗效果的影响，为细菌介导的肿瘤治疗与其它药物的协同作用的研究提供理论依据。 本试验材料为:以减毒鼠伤寒沙门氏菌（S.t△ppGpp菌株）、IFN-γ、BalB/c小鼠 1）S.t△ppGpp+IFN-γ联合作用抗小鼠结肠癌的研究。本试验将达到5-6周龄BalB/c雄性小白鼠每只注射1×106个CT26细胞到小鼠肌皮下建立结肠癌小鼠模型。当肿瘤的体积长到120-180mm3时，当天尾静脉注射1 μg/IFN-γ,第二天尾静脉注射100 μL细菌（只注射1次:细菌注射量为3×107CFU/只），之后每天尾静脉注射1μg/只IFN-γ21天。肿瘤体积=（L×H×W）/2。从肿瘤生长曲线可看到，小鼠注射细菌后7天内，肿瘤体积逐渐坏死减小且结痂脱落，但结痂脱落后肿瘤又会渐渐复发。 而S.t△ppGpp+IFN-γ联合治疗组相较单独S.t△ppGp菌组有显著增强的肿瘤抑制效果，甚至使肿瘤完全脱落:联合处理的小鼠中（27％）显示完全肿瘤消退，且比其他组存活时间更长，在剃毛的右侧部重新生长毛发并保持健康直至第60天观察停止。这表明，减毒鼠伤寒沙门氏菌在具有一定的抗肿瘤效果基础上，联合IFN-γ治疗肿瘤起到了增强抗肿瘤效果。 2）S.t△ppGpp+IFN-γ联合作用对肿瘤中细菌靶向的影响。本试验在细菌注射后第二和第六天，将单独菌组和联合治疗组小鼠脱颈死。采集小鼠的肿瘤、肝、脾、肺按重量（g）∶PBS体积（mL）=1∶9的比例进行机械匀浆，37℃过夜培养，算得每克组织中所含细菌数。以此来研究IFN-γ对S.t△ppGpp/Lux（菌株转入Lux荧光基因）工程菌靶向肿瘤能力以及在肿瘤中存留时间的影响。从小鼠活体发光成像显示，S.t△ppGpp+IFN-γ联合治疗不影响细菌在肿瘤中积累增殖的能力，在细菌注射后1-3天全部定植在肿瘤部位。在第2天和第6天细菌计数统计结果可看到，联合治疗组和单独菌组这两组的肿瘤内部聚集细菌数都远远高于其他脏器，差异极显著（P＜0.001）。特别是细菌注射处理后第六天，联合治疗组肿瘤中细菌数差异显著（P＜0.05）高于单独菌治疗组;由此可以看出，IFN-γ能增强S.t△ppGpp工程菌靶向肿瘤内部能力并存在一定的时间。 3）S.t△ppGpp+IFN-γ联合作用对肿瘤微环境的影响。本试验通过将细菌注射48h后采集肿瘤组织进行常规免疫组化。使用中性粒细胞一抗ly6G（兔抗大鼠1∶100）、巨噬细胞M1型一抗CD86（兔多抗1∶50）和巨噬细胞M2型一抗CD206（兔多抗1∶200）孵育，二抗生物标记的羊抗兔/大鼠IgG孵育。IHC结果显示肿瘤组织在细菌浸润后，观察到M1/M2型巨噬细胞数量相对于对照组和单独IFN-γ组来说，联合治疗组和单独菌组明显增多且存在差异极显著（P＜0.001）;同时联合治疗组M1/M2型巨噬细胞数量相对于单独菌组的差异显著上升（P＜0.05）;尤其M1型巨噬细胞比M2型巨噬细胞差异极显著增多（P＜0.001） 对于中性粒细胞，单独菌组比对照组和单独IFN-γ组显著上升，差异极显著（P＜0.001）;而联合治疗组比单独菌组中性粒细胞募集明显下降，差异极显著（P＜0.001）。这些结果表明IFN-γ对细菌浸润肿瘤后明显诱导巨噬细胞M1/M2极化和抑制了中性粒细胞的募集。 4）S.t△ppGpp+IFN-γ联合治疗肿瘤中相关细胞因子变化。由于在减毒鼠伤寒沙门氏菌定植肿瘤后中引起了不同免疫细胞群体浸润，产生的效应分子可能参与抗肿瘤作用。因此，我们接下来研究了肿瘤的免疫学变化。用qRT-PCR检测 S.t△ppGpp+IFN-γ联合治疗48h相关细胞因子表达的变化。结果发现，相比于对照组和单独IFN-γ组，单独菌组的IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF 和联合治疗组的TGF-β、IL-6、IL-10、GM-CSF的转录水平均较高表达，差异极显著（P＜0.001）;联合治疗组的IL-1β、TNF-α、GM-CSF的转录水平均高表达，差异显著（P＜0.05）。而联合治疗组的G-CSF和单独菌组相比，差异显著降低（P＜0.05）。因此可以推测S.t△ppGpp+IFN-γ联合处理后，较单独菌组降低了G-CSF（粒细胞集落刺激因子）转录水平，有效阻抑了中性粒细胞的募集;同时引起巨噬细胞分泌的IL-1β（白细胞介素1β）、抗炎因子IL-10（白细胞介素10）和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）等相关炎症细胞因子增加表达，增强了抑制肿瘤生长效果。 综上所述，S.t△ppGpp+IFN-γ联合治疗能通过诱导巨噬细胞M1/M2极化以及促进中性粒细胞凋亡减少募集数量来抑制肿瘤的作用，为联合免疫治疗模式提供策略。
NETL