摘要
目的： 药物代谢酶(Drug-metabolizing enzymes,DMEs)是一类负责催化药物等异物质生物转化的酶，其不仅深刻影响药物体内效应的发挥，还与多种疾病的发生发展密切相关。UGT1A1是一类重要的Ⅱ相药物代谢酶，参与多种酚类药物的代谢清除。UGT1A1在多种肿瘤细胞中高表达，其介导的药物失活被认为是肿瘤耐药的重要机制之一，抑制或降解肿瘤细胞中的UGT1A1能够增强其底物药物(如喜树碱衍生物SN38、依托泊苷等)的抗肿瘤作用。然而，UGT1A1主要在肝脏中表达，维持体内胆红素的代谢稳态，降解肝脏中的UGT1A1会引起严重的毒副作用。因此，设计研发可特异性降解肿瘤组织中UGT1A1的分子，对于增强UGT1A1底物药物的抗肿瘤作用具有重要意义。 食管癌(Esophageal cancer,EC)是一类常见的消化系统恶性肿瘤，具有发病率高、死亡率高、易转移等特点，5年生存率约为10-15％。伊立替康(喜树碱类药物SN38的前药)常被用于治疗食管癌，其活性代谢产物SN38易被UGT1A1代谢为无活性的代谢产物SN38G。本课题拟系统开展:1)UGT1A1在食管癌中的表达、活性与SN38代谢的关系;2)设计合成并优选出可有效降解细胞内UGT1A1的降解剂(PROTAC3);3)构建肿瘤微环境响应性的PROTAC@PEG-PDEA纳米胶束靶向肿瘤组织;4)在动物层面评价降解肿瘤中的UGT1A1来增强SN38的抗肿瘤作用。 方法： 1、借助UGT1A1特异性荧光底物及Western blot技术分别检测食管癌临床样本及食管癌肿瘤细胞中UGT1A1的活性及表达;同步检测细胞培养上清中SN38的减少量来表征细胞代谢SN38的能力;进一步通过siRNA敲减UGT1A1,并考察与SN38联用对细胞增殖、克隆的影响。 2、以PROTAC为蛋白靶向降解策略，通过分子对接、E3泛素连接酶的选择以及Liner优化，理性设计并合成了一系列的UGT1A1的降解剂分子并进行表征。 3、通过Hela-UGT1A1稳转细胞株，借助CETSA、MST、Western blot、质粒转染等技术考察PROTAC 3分子的结合亲和力、降解活性和降解选择性，通过细胞共定位、Co-IP等手段考察PROTAC 3分子的降解机制，采用Fluoppi荧光技术检测UGT1A1-PROTAC 3-VHL三元复合物形成;进一步考察PROTAC分子对食管癌细胞OE19中UGT1A1的降解作用，以及与SN38联用的抗肿瘤作用。 4、以pH敏感的PEG-PDEA聚合物为材料，通过自组装方式将PROTAC 3包裹形成载药纳米胶束并进行表征与体外药物释放能力考察，在体外细胞上借助流式细胞术与激光共聚焦显微镜考察胶束的细胞摄取能力;进一步通过荷瘤小鼠模型，小动物活体成像技术考察纳米胶束的体内组织分布以及肿瘤靶向性能。 5、构建食管癌细胞OE19小鼠异种移植瘤模型，考察PROTAC 3分子以及载药纳米胶束与SN38联用的抗肿瘤作用，并通过免疫组化等技术考察其对肿瘤中UGT1A1的降解作用;进一步在小鼠层面考察PROTAC 3分子的安全性。 结果： 1、在部分食管癌临床样本中，UGT1A1的表达和活性较癌旁组织显著提高;相较正常食管上皮细胞，UGT1A1在食管癌细胞（OE19）细胞中的表达高4.39倍，活性强2.39倍;SN38对高表达UGT1A1的OE19细胞的毒性较弱，其IC50为59.14μM。进一步发现:敲减UGT1A1对OE19细胞的增殖、克隆影响较小，但是其可显著增强SN38的抗肿瘤作用。 2、以UGT1A1的特异性底物NCHN作为靶蛋白的配体，其可与UGT1A1上的GLU182、CYS177和PHE181形成氢键作用，而碳链上的羧基处于结合口袋的外侧，暴露于溶剂区，是一个合适连接位点;以VHL ligand 1作为E3泛素连接酶配体，并优化linker的结构及长度设计研发了首个UGT1A1的降解剂分子（PROTAC 3）。 3、PROTAC 3分子能够进入活细胞中，与UGT1A1直接结合，其结合亲和力（Kd）为20.1 μM;同时PROTAC 3分子在细胞内能够与内质网共定位，Fluoppi结果显示，其与VHL和UGT1A1可有效形成三元复合物，劫持泛素分子，并被泛素蛋白酶体系统识别，进而降解UGT1A1,其最大降解能力(Dmax)为73％,DC50为2.56μM;PROTAC 3显示出了较好的选择性，其对UG1A3无降解作用，对UGT1A9降解作用较弱;PROTAC3分子能够以浓度/时间-依赖的方式降解食管癌细胞OE19中的UGT1A1,持续作用24 h;而且与SN38联用增强SN38的抗肿瘤作用。 4、成功合成了具有肿瘤微环境响应性的PROTAC@PEG-PDEA载药纳米胶束，TEM显示其大小均一，形态似球形及类球形，DLS测定其粒径为128 nm,Zeta 电位为8.06 mV,载药量大约为15.8％;体外环境具有pH敏感的药物释放特征，其在pH 6.5的磷酸缓冲液中72 h累积释放达59.1％,而在pH 7.4的磷酸缓冲液中72 h仅释放25.7％;PROTAC@PEG-PDEA体外显示出快速的细胞摄取能力;小动物活体成像表明PROTAC@PEG-PDEA具有明显增强的肿瘤部位聚集现象，可有效减少肝脏的药物摄取。 5、体内抗肿瘤实验结果显示，相较单用SN38,PROTAC 3和PROTAC@PEG-PDEA与SN38联用显示更强的抗食管癌作用;免疫组化、Western blot结果表明PROTAC 3和PROTAC@PEG-PDEA降解肿瘤组织中UGT1A1,抑制SN38代谢为无活性的SN38G;相较PROTAC3,PROTAC@PEG-PDEA可有效靶向肿瘤部位进而减少肝脏对PROTAC 3分子的摄取，因此在动物整体显示出了更好的安全性。 结论： 本研究发现部分食管癌中UGT1A1的表达和活性均显著提升，SN38可被食管癌细胞中高表达的UGT1A1代谢为无活性的SN38G进而出现耐受现象。基于此，我们创新性地设计研发了首个UGT1A1的降解剂（PROTAC 3），其能够进入活细胞中与UGT1A1和VHL形成三元复合物，劫持泛素分子，被泛素-蛋白酶体系统识别，以浓度/时间依赖的方式降解肿瘤细胞中的UGT1A1,增强SN38的抗肿瘤作用。 为避免PROTAC 3分子对肝脏UGT1A1的降解，进一步设计合成了肿瘤微环境响应的PROTAC@PEG-PDEA载药纳米胶束;PROTAC@PEG-PDEA显示出明显的pH敏感药物释放性能，且展现出肿瘤靶向累积特性。体内研究显示:PROTAC@PEG-PDEA可有效降解肿瘤组织中的UGT1A1,进而阻断SN38代谢为无活性的SN38G,增强SN38的抗肿瘤效果。同时，得益于肝脏的PROTAC 3分子摄取减少，PROTAC@PEG-PDEA在动物整体上显示出较好的安全性。
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