摘要
动物遗传资源的保存和利用是畜牧业高质量发展的关键保障。配子、胚胎和体细胞的冷冻保存是实现动物种质资源长期稳定保存和跨时空利用的关键技术手段，极大的推动了家畜的育种和群体改良。但冷冻导致胚胎氧化损伤、脂质过氧化、结构破坏和膜损伤等问题也限制了该技术进一步发展，同时冷冻胚胎移植后代的健康更是非常值得关注的话题。褪黑素（Melatonin，MT）是一种强效抗氧化剂和自由基清除剂，众多研究发现褪黑素能改善动物胚胎质量，提高胚胎发育和移植效率，具有成为一种新型抗冻保护剂的潜力。目前，关于褪黑素在冷冻解冻液中降低胚胎冷冻损伤的研究尚缺少，本研究在小鼠和绵羊的桑葚胚冷冻解冻液中添加褪黑素，探究其对胚胎冷冻保存效果的影响。开展了如下研究: 1.探究了冷冻解冻液中添加褪黑素对小鼠桑葚胚冷冻效果的影响。将小鼠体外桑葚胚在添加不同浓度（0、10-3、10-5和10-7 mol/L）褪黑素的冷冻解冻液中处理，发现10-5mol/L的褪黑素是促进胚胎发育的最佳浓度。对比了玻璃化冷冻（V）、冷冻解冻时加入10-5 mol/L的褪黑素作为保护剂（V-MT）以及新鲜（F）的小鼠体内桑葚胚的发育效率、氧化凋亡水平和线粒体功能。结果表明，冷冻解冻液中添加10-5 mol/L褪黑素可以显著提高冷冻胚胎解冻后的孵化囊胚细胞数和内细胞团比例（94.93±2.13 vs 83.50±4.09，28.51±0.94％vs 24.75±1.03％,P＜0.05）,囊胚率和孵化囊胚率（96.3％vs 80.0％,74.10％vs60.0％，P＞0.05）有提高的趋势，与新鲜组无显著差异（96.30％vs 97.60％,74.10％vs 87.80％,P＞0.05）。将桑葚胚发育12 h的囊胚移植后，褪黑素添加组的平均产仔数和断奶数显著高于冷冻组（6.22±0.68 vs 3.89±0.37,6.22±0.68 vs 3.78±0.36,P＜0.05）,产仔率有提高的趋势（44.44％vs 32.14％，P＞0.05）,与新鲜组无显著差异（44.44％vs 52.14％,P＞0.05）。与新鲜组相比，冷冻组冻融后胚胎的线粒体膜电位和ATP水平显著下降，活性氧（ROS）水平显著升高（P＜0.05），添加褪黑素后，线粒体膜电位和ATP水平显著上升，ROS水平显著下降（P＜0.05）。因此，这些结果表明，褪黑素通过发挥抗氧化作用来提高冷冻胚胎线粒体功能从而降低冷冻损伤。 2.为研究褪黑素改善小鼠胚胎冷冻效果的机制，对玻璃化冷冻（V）、冷冻解冻液添加10-5 mol/L褪黑素（V-MT）以及新鲜（Fresh）的小鼠体内桑葚胚发育24 h的囊胚进行单胚胎转录组测序分析。结果表明，玻璃化冷冻主要影响囊胚的氨基酸、脂肪酸的降解、丙酮酸代谢与糖代谢途径，说明玻璃化冷冻通过改变胚胎的代谢模式影响其发育潜力。褪黑素通过降低冷冻导致的Rela与Nfkb1的超表达从而抑制NF-κB信号过度激活，减轻了胚胎的代谢受损，尤其是核苷酸的合成，褪黑素缓解了冷冻引起的核苷酸合成调控基因Ctps2、Nme4、Gmps、Nudt2、Ppat、Impdh2的表达下降，有利于细胞分裂与增殖。褪黑素还恢复了冷冻胚胎线粒体功能基因Sucla2和Timm17a的表达。因此推断褪黑素通过改善小鼠冷冻胚胎的细胞代谢、线粒体活动、大分子物质合成过程以及核苷酸合成来缓解冷冻损伤。 3.研究了不同胚胎冷冻方法的差异及褪黑素提高胚胎冷冻效果的机制。首先，对比绵羊玻璃化冷冻胚胎、程序化冷冻胚胎及新鲜桑葚胚移植效率，发现玻璃化冷冻胚胎移植后的妊娠率和产羔率显著高于程序化冷冻（54.20％vs 44.00％;52.10％vs 42.60％,P＜0.05）。对11枚新鲜绵羊桑葚胚（fresh）、9枚玻璃化冷冻桑葚胚（frozen）和7枚冷冻解冻液中添加 10-5 mol/L褪黑素的冷冻桑葚胚（melatonin）进行单胚胎转录组测序。结果显示，与鲜胚相比，冷冻胚胎的差异表达基因主要在蛋白激酶活性、粘附过程、钙信号通路以及Wnt、PI3K/AKT、Ras、ErbB和MAPK信号通路中富集。而褪黑素处理可上调激酶活性、ErbB和PI3K/Akt信号等关键通路的表达，从而增强桑葚胚对玻璃化冷冻损伤的抵抗力。褪黑素还通过上调XPA和HIF1A来促进冷冻胚胎DNA修复从而发挥保护作用。 4.为评估褪黑素对冷冻胚胎后代的影响，对比了小鼠新鲜胚胎移植（F，体内桑葚胚体外发育12h的囊胚）、冷冻胚胎移植（V）、冷冻解冻液添加褪黑素的冷冻胚胎移植（V-MT）以及自然受孕母鼠（C）的孕产情况、后代的生长发育、主要器官病变及血液生理生化水平。结果表明，四组小鼠受体的妊娠率和妊娠期没有显著差异（P＞0.05）。三个胚胎移植组（F、V、V-MT）的后代初生重显著高于C组（P＜0.05）。在出生后3周哺乳期内，胚胎移植后代增重速率显著高于C组（P＜0.05）,尤其是V组后代母鼠增重最快。但是，断奶后，V组后代增重速率显著下降（P＜0.05）,而V-MT后代的增重速率得到校正（P＜0.05）,与F组或C组后代增重速率无显著差异（P＞0.05）。11周龄冷冻胚胎后代母鼠的肝脏系数和公鼠的附睾系数显著下降（P＜0.05）,而V-MT后代恢复正常。各组11周龄后代血常规指标没有显著差异（P＞0.05）,组织切片也无明显病变。各组20周龄后代公母鼠的肝脏系数没有显著变化（P＞0.05），但是冻胚移植后代公鼠的血清中ALT、TP、GLB、A/G水平出现异常，提示肝功能受损。说明冷冻解冻液中添加褪黑素在一定程度上改善了冷冻胚胎后代出现的异常情况。 综上所述，在小鼠和羊的胚胎冷冻解冻液中添加褪黑素，可以提高冻融后胚胎的发育效率和质量，进而部分校正冷冻损伤引起的胚移后代发育异常。褪黑素通过促进冷冻胚胎的DNA修复和核苷酸合成共同维持核酸稳定从而发挥其冷冻保护作用。
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