摘要
丹灯通脑软胶囊（DanDengTongNao soft Capsule，DDTNC）是临床上治疗缺血性脑血管疾病的中药复方制剂，但是药效作用机制尚未完全明确。 目的: 从体内外两个层次，探讨丹DDTNC对脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)大鼠血管新生的保护作用及机制，以期为DDTNC的临床应用提供实验依据。 方法: 1、网络药理学预测DDTNC对CIRI的保护作用机制 (1)在TCMSP、HERB数据库中检索DDTNC相关的靶点。 (2)以“脑梗死(cerebral infarction)”为关键词，在Genecard、TTD和OMIM数据库中检索其相关靶点。 (3)将DDTNC相关靶点和脑梗死相关靶点取交集。 (4)将交集靶点分别导入STRING和DAVID网站，分别获取PPI网络和GO、KEGG的结果。 (5)通过微生信网站将GO和KEGG富集分析的结果可视化。 2、DDTNC调控HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路促进MCAO/R大鼠血管新生的实验研究 (1)方法学考察 ①稳定性试验:精密吸取DDTNC的供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定相对峰面积并计算RSD值。 ②精密度试验:精密吸取DDTNC的供试品溶液，重复进样6次，测定相对峰面积并计算RSD值。 ③重复性试验:取同一批次DDTNC样品，平行制备6份供试品溶液，测定相对峰面积并计算RSD值。 (2)UPLC体外检测DDTNC主要化学成分。 (3)采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞/复通(Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion，MCAO/R)的局灶性脑缺血再灌注损伤模型，并进行神经行为学评分。 (4)采用TTC染色法检测各组大鼠脑梗死体积。 (5)HE染色法检测各组大鼠脑组织皮层神经元损伤情况。 (6)透射电镜观察各组大鼠缺血皮质区线粒体超微结构的变化。 (7)免疫荧光染色法观察大鼠缺血皮质区HIF-1α、VEGFA、VEGFR2，CD31及CD34的表达。 (8)ELISA检测大鼠血清中促血管生成因子(VEGF、BDNF、bFGF)和抑制血管生成因子(Angiostatin，Endostatin)的含量。 (9)Western Blot检测各组大鼠缺血皮质区HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Notch1，Dll4及Hes1蛋白表达量。 3、DDTNC含药脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)通过HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路促进OGD/R损伤BMECs血管新生的实验研究 (1)采用一次性静脉输液针经延髓池提取DDTNC-CSF。 (2)采用具有5％CO2及95％N2的缺氧小室的培养箱和DMEM无糖培养基建立OGD/R损伤BMECs模型。 (3)DDTNC-CSF作用于OGD/R损伤BMECs最适浓度筛选。 (4)CCK8法检测DDTNC-CSF对OGD/R损伤BMECs增殖活性的影响。 (5)LDH试剂盒检测各组BMECs上清液中LDH释放量。 (6)荧光倒置显微镜观察DDTNC-CSF对BMECs内ROS荧光强度的影响。 (7)Hoechst 33258检测各组BMECs凋亡的情况。 (8)透射电镜观察各组BMECs中线粒体的超微结构。 (9)ELISA法检测细胞上清液中促进血管生成因子(VEGF、bFGF、BDNF)及抑制血管生成因子(Angiostatin、Endostatin)的含量。 (10)划痕实验法检测DDTNC-CSF对BMECs迁移能力的影响。 (11)Transwell实验检测DDTNC-CSF对BMECs迁移能力的影响。 (12)Tube Formation实验检测DDTNC-CSF对BMECs成管能力的影响。 (13)Western Blot检测BMECs中HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Notch1,Dll4及Hes1蛋白的表达。 结果: 1、DDTNC的网络药理学分析 (1)DDTNC的相关靶点共254个。 (2)脑梗死的相关靶点605个。 (3)DDTNC和脑梗死的交集靶点共62个，KEGG富集的相关性较强的信号通路是HIF-1信号通路。 2、DDTNC调控HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路促进MCAO/R大鼠血管新生的实验研究 (1)方法学考察结果 ①稳定性试验:测定DDTNC主要化学成分的相对峰面积，计算得出的RSD值均小于3％，表明DDTNC供试品溶液在24h内稳定。 ②精密度试验:测定DDTNC主要化学成分的相对峰面积，计算得出的RSD值均小于3％，表明仪器精密度良好。 ③重复性试验:测定DDTNC主要化学成分的相对峰面积，计算得出的RSD值均小于3％，表明其重复性较好。 (2)通过UPLC鉴定出DDTNC中7种活性成分:丹参素、葛根素、大豆苷、野黄芩苷、洋川芎内酯I、丹酚酸A及丹酚酸B。其中，大豆苷和葛根素是葛根的主要成分，丹参素、丹酚酸A和丹酚酸B是丹参的主要成分，洋川芎内酯I是川芎的主要成分，野黄芩苷是灯盏细辛的主要成分。 (3)与模型组相比，DDTNC能有效降低MCAO/R大鼠的行为学评分和脑梗死体积。 (4)与假手术组相比，模型组的大鼠脑组织皮层神经元排列紊乱，核固缩。相较于模型组，DDTNC能显著改善MCAO/R大鼠脑组织神经元的病理损伤。 (5)透射电镜结果显示，DDTNC可以有效减轻MCAO/R大鼠脑组织缺血皮质区线粒体肿胀。 (6)与假手术组相比，模型组大鼠缺血梗死区的HIF-1α、VEGFA、VEGFR2，CD31及CD34的荧光强度增强。DDTNC进一步增强了这些指标的荧光强度。而PX-478的作用则完全相反。表明DDTNC可以促进MCAO/R大鼠缺血梗死区血管生成。 (7)ELISA结果显示，相较于模型组，DDTNC显著上调VEGF、bFGF、BDNF等血管生成因子的含量，同时下调Angiostatin、Endostatin抑制血管生成因子的生成。 (8)Western Blot结果显示，与模型组相比，DDTNC能明显上调HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、Notch1，Dll4及Hes1蛋白的表达。PX-478则显著逆转了这一作用。表明DDTNC促进MCAO/R大鼠缺血梗死区血管生成可能与HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路有关。 3、DDTNC含药脑脊液通过HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路促进OGD/R损伤BMECs血管新生的实验研究 (1)CCK-8法筛选出10％DDTNC-CSF为作用于OGD/R损伤BMECs的最适浓度。 (2)CCK-8法结果显示，与OGD/R组相比，DDTNC-CSF显著提高BMECs的活力。 (3)与Normal Control组相比，OGD/R组的LDH释放量明显增多，而DDTNC-CSF可显著减少LDH的释放量相较于OGD/R组。 (4)与OGD/R组相比，DDTNC-CSF可以明显降低OGD/R损伤后BMECs的ROS荧光强度。 (5)Hoechst33258荧光染色实验结果表明，与OGD/R组相比，DDTNC-CSF可以明显降低OGD/R损伤后BMECs中Hoechst33258的荧光强度。 结论: 1、DDTNC可以通过促进大鼠脑缺血再灌注损伤后血管新生发挥脑保护作用。 2、DDTNC促进大鼠脑缺血再灌注损伤后血管新生的作用与激活HIF-1α-VEGFA-Notch1信号通路有关。
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