摘要
化疗是恶性肿瘤重要的治疗方法，其中，紫杉醇是常用的化疗药物之一，广泛应用于肺癌、食管癌等癌种。但由于药物在肿瘤组织中无法特异性积累及较差的渗透能力，导致其对人体正常组织产生严重毒性，影响患者的生活质量及预后结局。紫杉醇是一种天然产物，可以通过结合长链脂肪酸来提高其溶解度和稳定性。长链脂肪酸，如亚油酸、棕榈酸和硬脂酸等，都可以与紫杉醇形成酯键结合，形成紫杉醇脂肪酸衍生物，这些衍生物具有良好的水溶性和更好的药物性质，可以更容易地进入细胞产生更强的治疗效果。此外，结合长链脂肪酸的紫杉醇衍生物还可以通过口服给药，改善生物利用度和减少毒副作用，这也为肿瘤临床治疗提供了新思路。 本研究通过酯键合成紫杉醇(Paclitaxel,PTX)与18碳α，ω-二烯酸(ODDA)制备获得PTX-ODDA前药，前药中长链脂肪酸与人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)结合形成非共价复合物，同时拉帕醌(β-lapachone)与PTX通过π-π叠合，构建一种新型纳米给药系统。一方面，PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒可增加药物内吞率，避免使用毒性较大的增溶剂。另一方面，肿瘤组织高表达NQO1辅酶，β-lapachone在其作用下产生具有细胞毒性的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),实现与PTX的协同治疗效果。课题研究主要内容和结果包括以下三部分: 1.PTX-ODDA的合成及表征，以及纳米粒的制备和理化性质考察 方法:通过酯化反应将PTX和ODDA连接，采用核磁共振氢谱法(1H-NMR)、质谱法(MS)验证上述物质成功合成。利用纳米沉淀法制备纳米粒，β-lapachone与PTX的通过π-π叠合引入构建一种新型纳米给药系统，筛选PTX-ODDA和β-lapachone的最佳比例。结果:当PTX-ODDA和β-lapachone摩尔比为1∶3共载时，由于π-π相互作用，PTX-ODDA具有更高的载药量为4.26％，包封率为61.29％。纳米粒平均粒径为130.3nm,PDI为0.251,平均Zeta电位为-18.38 mv,纳米粒的外观形态学观察可以发现PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒呈规则的球形。2.PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒的体外抗肿瘤评价及作用机制 方法:采用CCK8法考察游离药物和不同纳米粒对黑色素瘤细胞(B16细胞)的细胞毒性。利用细胞流式凋亡实验和周期阻滞实验评估PTX、PTX-ODDA/HSA、PTX-ODDA/β-lapachone/HSA诱导细胞凋亡和周期阻滞的能力。培养处于对数生长期的B16细胞，除对照组外，分别给药β-lapachone、PTX、PTX-ODDA/β-lapachone/HSA,24h后提取各组总蛋白，采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测各药物组对NQO1/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的影响，结果:不同摩尔比的PTX-ODDA和β-lapachone的细胞毒性结果表明两者联合可实现协同治疗效果。对比游离 PTX和PTX-ODDA/HSA纳米粒(未结合β-lapachone),PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒细胞吸收能力更强，说明纳米粒更易被肿瘤细胞内吞。同时，PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒具有更强的诱导细胞凋亡能力;PTX、PTX-ODDA/HSA、PTX-ODDA/β-lapachone/HSA 可以将细胞阻断在各期。从蛋白免疫印迹实验分析结果来看，PTX-ODDA/β-lapachone/HSA处理组NQO1、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平显著低于对照组，表明PTX-ODDA/β-lapachone/HSA在体外通过调控PI3K/AKT/mTOR影响黑色素瘤细胞的增殖。 3.PTX-ODDA/β-lapachone/HSA纳米粒的体内抗肿瘤评价 方法:在Balb/c小鼠右侧腋下皮下注射B16细胞悬液构建荷瘤小鼠模型，每隔2d分别对小鼠进行尾静脉注射生理盐水(Saline)、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、PTX-ODDA/HSA 纳米粒、PTX-ODDA/β-lapachone/HSA 纳米粒，并测量小鼠的体重和肿瘤体积。21d后，麻醉处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织，4％多聚甲醛中固定，并进行H&E染色分析。结果:纳米粒组可显著减缓小鼠体重和肿瘤体积的增长速度，且对小鼠的进食量无明显影响。同时，结合各组肿瘤组织、器官的病理学切片观察，进一步证明，PTX-ODDA/HSA纳米粒组可降低药物毒性，表现出更好的抑瘤效果。
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