摘要
维生素D受体(VDR)和维生素D代谢酶存在于雄(男)性生殖器官各种类型细胞，并且有较高表达。维生素D缺乏导致精子质量和数量显著降低。1，25(OH)2D3可通过VDR介导的下游通路抑制睾丸组织细胞的铁死亡而改善生殖能力受损。基于此，我们推测VDR作为核受体激活Nrf2、减少ROS的积聚，抑制睾丸组织细胞的铁死亡，从而改善雄性生殖障碍。 补肾中药能够防治骨质疏松、缓解肾功能损伤、改善性腺功能衰退等肾虚相关病症的作用，具有VDR激动剂样作用。我们可考虑从补肾中药中筛选VDR激动剂样作用化合物，来治疗不育。 研究目的: 本研究旨在探索VDR激动剂改善肥胖导致的生殖障碍的药理机制，由补肾中药挖掘具有类VDR激动剂样作用的化合物，为防治肥胖的生殖系统功能异常提供新策略和新靶点。 研究方法: (1)观察VDR-/-和野生型小鼠的睾丸及附睾病理学变化，检测精子畸形率，评估VDR-/-小鼠生殖能力改变受损情况。透射电镜观察精母细胞线粒体形态变化、免疫荧光检测睾丸组织切片中ROS含量，来评估VDR-/-小鼠的睾丸组织中是否发生铁死亡。 (2)高脂饲料喂养C57小鼠8周，建立肥胖小鼠模型。检查其睾丸病理学变化及精子活力，确立是否建立了肥胖导致的生殖障碍模型。 (3)肥胖导致的生殖障碍小鼠模型建立后，VDR激动剂—帕立骨化醇治疗6周。观察各组睾丸及附睾病理学，检测精子畸形率、精子活力，评价帕立骨化醇对模型小鼠生殖能力的影响。透射电镜观察睾丸组织中精母细胞的线粒体形态变化，ELISA试剂盒检测血清中睾酮含量、睾丸组织中MDA、SOD、Fe2+、GSH含量，WB检测GPX4、Nrf2、p53、p21、p16的表达水平，探讨帕立骨化醇对睾丸组织中细胞铁死亡信号通路的影响。 （4）考虑帕立骨化醇及其制剂辅料丙二醇的毒副作用，我们必须寻找其他活性更好或类似、毒副作用更小的VDR激动剂代替帕立骨化醇。从经典补肾中药及补肾中药方剂中挑选化合物，运用分子虚拟对接技术将其与3种VDR蛋白进行分子对接，筛选出与VDR结合力评分最高的化合物。 （5）筛选出的10个候选化合物，与放射性标记的维生素D竞争结合VDR。以放射性标记的维生素D的放射活性来评估化合物与VDR的结合能力，与VDR结合能力最强的化合物为女贞子药材中的红景天苷。 （6）肥胖导致的生殖障碍小鼠模型建立后，红景天苷给药6周。观察各组睾丸及附睾病理学改变，检测精子畸形率、精子活力，评价其对肥胖导致的生殖障碍小鼠生殖能力的影响。利用透射电镜观察精母细胞的线粒体形态变化，ELISA试剂盒检测血清中睾酮、睾丸中MDA、SOD、Fe2+、GSH含量，WB检测GPX4、Nrf2、p53、p21、p16的表达水平，探讨红景天苷对铁死亡信号通路的影响。 研究结果: （1）与野生型小鼠比，VDR-/-小鼠生精功能受损严重，睾丸组织中线粒体变小、膜密度增高、嵴减少，具有典型的铁死亡细胞形态学特征;细胞内活性氧（ROS）升高，表现为铁死亡细胞成分方面的特征变化。 (2）成功建立肥胖导致的生殖障碍小鼠模型，体重增加51.7％，生精功能受损严重，具有典型的铁死亡特征。 （3）帕立骨化醇可剂量依赖性减轻肥胖导致的生殖障碍小鼠的体重，提高睾丸、附睾和精囊腺的脏器系数;增加精原细胞和精子细胞数量;促进睾丸间质细胞增殖，提高血清中睾酮含量。 （4）帕立骨化醇改善生殖障碍的机制研究显示，帕立骨化醇可促进睾丸组织中抗氧化系统中SOD酶活力提高、抑制ROS的产生，保护生精细胞免受氧自由基的攻击，进而减少了丙二醛（MDA）和4-HNE的产生。帕立骨化醇上调了抗氧化体系（谷胱甘肽系统）的调控核心酶GPX4的表达，产生对铁死亡的耐受;提高了 Nrf2和GSH等抗氧化蛋白的含量，同时降低细胞周期调节因子p53、p21、p16的蛋白表达，并通过调节Fe2+含量，促进线粒体形态恢复正常。 （5）17味入肾经药材的1640个化合物与3种VDR的晶体结构进行虚拟分子对接。按照Surflex-Dock规定，对接后Total Score小于5分，即认为对接的小分子不能作为受体蛋白的配体;挑选出结合力最好的10个化合物进行体外实验，做VDR的放射免疫竞争结合分析。结果发现，女贞子药材中的红景天苷与VDR结合的IC50=7.7×10-7M,RBA与VDR之比为0.13％,红景天苷与VDR结合能力是这10个化合物中最强的。 (6)用肥胖导致的生殖障碍模型验证红景天苷的药效，发现红景天苷可增加睾丸中精原细胞和精子细胞数量，以及附睾中精子数量;促进睾丸间质细胞增多以及增加血清中睾酮含量。 (7)红景天苷促进肥胖小鼠睾丸组织中SOD酶活力，抑制ROS的产生，减少MDA的产生;提高了 Nrf2、GSH和GPX4蛋白含量，抑制Fe2+蓄积，下调p53、p21、p16的表达，恢复精母细胞线粒体形态，保护肥胖小鼠的生精能力。 研究结论: (1)VDR缺失引起的铁死亡，可能是睾丸组织中精母细胞受损导致动物生殖能力下降的重要原因。 (2)VDR激动剂—帕立骨化醇，能够减轻肥胖导致生殖障碍模型小鼠的体重，抑制铁死亡，保护受损精母细胞。 (3)红景天苷调控Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡，改善生精细胞损伤。 (4)VDR/Nrf2/GPX4信号通路有望成为治疗生精障碍的有效干预靶点。
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