摘要
目的： 本研究以脑缺血再灌注损伤大鼠为研究对象，进一步探讨大黄素在大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用，并阐明其中可能的机制。 方法： 1.随机将雄性SD大鼠分为对照组（Control）、假手术组（Sham）、缺血再灌注（Ischemia reperfusion,IR）模型组，IR组分为6h组、12h组、24h组、48h组、72h组、1w组（n=14/组）。IR模型组通过大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立。采用TTC （Triphenyltetrazolium chloride）染色明确有无梗死灶存在及其大小；HE（Hematoxylin and eosin）染色观察各组缺血半暗带区病理形态学变化；免疫荧光技术检测NLRP3、Caspase 1和GSDMD蛋白在细胞内的定位情况。并采用WB(Western blotting)测定各组脑缺血再灌注损伤侧缺血半暗带脑组织中NLRP3、Caspase 1、GSDMD的表达情况，以筛选最佳干预时间。 2.选择最佳干预时间进行实验，随机将SD大鼠分为Control组（n=14）、Sham组（n=14）、MACO 24h模型组（n=14）和MCAO+大黄素不同剂量药物干预组（MCAO+Emodin）（n=14/组），24h+Emodin（Low-dose）(低剂量)10mg/kg、24h+Emodin（Medium-dose）(中剂量) 20mg/kg、24h+Emodin（High-dose）(高剂量) 40 mg/kg。MCAO+Emodin干预组于构建 MCAO大鼠模型前2h进行腹腔注射大黄素，后采用WB 检测NLRP3、Caspase 1、GSDMD炎性小体表达，TTC染色明确有无梗死灶存在及其大小；HE染色对比各组缺血半暗带区病理形态学变化情况；采用mNSS评分法对不同组别神经功能缺损程度进行评估；ELISA 法测定各组脑缺血再灌注损伤侧脑组织中IL-1β、IL-18的变化情况。 结果： 1. mNSS评分结果：除Control组、Sham组大鼠无神经功能缺损症状外， MCAO 24h组、24h+Emodin（Low-dose）组、24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin （ High-dose ）组均有不同程度的神经功能缺损症状，其中MCAO+Emodin 组的 mNSS 评分较 MCAO 24h 组相比降低，并且随着干预剂量的增加，评分逐渐下降，24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin（High-dose）组，与 MACO 24 h组相比，其差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 2. TTC 染色结果：Control 组、Sham 组未见梗死灶， MCAO 24h 组、MCAO+Emodin 组均有不同程度的梗死，其中MACO 24h组中脑梗死体积比明显，与 MACO 24 h组相比，MCAO+Emodin 组梗死体积比减少（Plt;0.05)； 3.HE染色结果：Control组、Sham组脑组织中，神经细胞排列整齐、形态规则，细胞核显示清晰，大小均匀。而在MCAO 24h组，缺血半暗带区神经细胞杂乱无章分布，细胞核大小不一，核颜色变深、固缩。经过大黄素干预后缺血半暗带区神经细胞存活多，细胞肿胀、细胞核显示及固缩程度有一定改善，缺血半暗带分界相对MCAO 24h组不明显。 4.免疫荧光染色结果：进一步免疫荧光检测显示Caspase 1、GSDMD、NLRP 3在大鼠脑组织广泛表达于细胞胞质中。 5.WB结果：在大鼠脑缺血再灌注后Caspase 1、NLRP 3、GSDMD蛋白在脑组织中表达存在动态变化，各蛋白表达水平随缺血再灌注时间的延长而逐渐升高，于MCAO 24h组表达最多，随后表达开始下降。MCAO 24h组与Control组比较，有显著性差异（P＜0.05）。予大黄素干预以后，在 Control组、Sham 组、MCAO 24h组、24h+Emodin（Low-dose）组、24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin （High-dose）组中Caspase 1、NLRP 3和GSDMD蛋白在大鼠脑缺血再灌注损伤侧缺血半暗带脑组织中均有表达。与Control组比较，Caspase 1、NLRP 3、GSDMD蛋白在MCAO 24h组、24h+Emodin（Low-dose）组、24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin（High-dose）组表达升高；与MCAO 24h组相比，Caspase 1、NLRP 3、GSDMD蛋白在24h+Emodin（Low-dose）组、24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin（High-dose）组表达下降，且随着干预剂量的增加，表达逐渐降低，24h+Emodin（Medium-dose）组、24h+Emodin（High-dose）组与MCAO 24h组相比，差异具有统计学意义(Plt;0.05)； 6.ELISA结果：IL-1β、IL-18在Control组、Sham 组、MCAO 24h组、24h+Emodin （ Low-dose ）组、24h+Emodin （ Medium-dose ）组、24h+Emodin （High-dose）组均有表达，24h+Emodin（Low-dose）组、24h+Emodin（Medium-dose）组和24h+Emodin（High-dose）组炎症因子（IL-1β、IL-18）水平显著低于MCAO 24h组，其中24h+Emodin（Medium-dose）组和24h+Emodin（High-dose）组与MCAO 24h组比较均有显著差异，差异具有统计学意义(Plt;0.05)。 结论： 大鼠脑缺血再灌注损伤后，细胞焦亡相关蛋白在脑组织中表达增加；大黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，其机制可能与调节 Caspase 1-GSDMD轴介导的细胞焦亡相关蛋白表达有关。
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