摘要
目的:1.体内实验部分制备COPD模型大鼠，研究电针“足三里”(ST36)与“肺俞”(BL13)对模型大鼠肺组织自噬及肺部炎症的调控。采用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导肺泡巨噬细胞(大鼠源)NR8383细胞建立细胞炎性模型，探讨TFEB介导的自噬在COPD肺部炎症中的作用。 方法:细胞实验组别及检测手段:采用终浓度为5％、10％、20％、40％CSE分别处理NR8383细胞24h、48h、72h,CCK-8法检测细胞活力;采用不同浓度CSE(5％、10％、20％)分别处理细胞24h，western blot检测自噬小体标志蛋白比值LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、自噬底物降解蛋白P62的表达;透射电镜观察细胞中自噬小体的数量变化。根据CCK-8和Western blot的实验结果，选择20％CSE,24h分别作为CSE的干预浓度和时间。分别使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)和激活剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理细胞以探讨自噬与炎症反应之间的关系;应用TFEB激活剂fisetin处理细胞探讨TFEB介导的自噬与CSE诱导的炎症反应之间的关系。ELISA法检测各组上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的水平;Western blot检测细胞内P62蛋白、TFEB核质蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白比值;免疫荧光法检测LAMP1的相对表达量及TFEB的核质分布情况。 2.动物及分组处理:根据随机原则，将48只状态良好的雄性成年SD大鼠分为6组:正常组、正常电针组、模型组、模型+CQ组、模型电针组、模型+CQ+电针组，8只/组。正常组每天正常饲养不做任何处理，正常电针组大鼠每日予以电针处理，每日30min，持续14天;模型组为采用单纯香烟烟熏方法复制COPD模型大鼠;造模结束后，予以模型电针组大鼠于电针治疗，1次/天，30min/次，共14天;模型制备成功后，使用自噬抑制剂氯喹(CQ)处理模型+CQ组大鼠，剂量为50mg/kg,持续4天;模型+CQ+电针组于造模结束后、电针前30min予以腹腔注射CQ(50mg/kg),持续 4 天。 3.COPD大鼠造模方法及评价:适应性饲养后，将大鼠置于体积为1m3的烟熏箱内，随后放入20支点燃的红三环香烟行香烟烟熏，1h/次，2次/天，两次烟熏之间间隔8小时，共12周。模型评价:肺功能明显受损，肺组织炎性病理表现明显，支气管肺泡灌洗液内炎性细胞因子明显增多。 4.电针治疗:予以COPD大鼠双侧“肺俞”（BL13）和“足三里”（ST36）电针治疗。以下为电针刺激参数:疏密波，频率4Hz/20Hz，持续0.5ms,强度1～3mA。一日一次，30min/次，共2周。 5.指标检测:麻醉后检测大鼠肺功能;HE染色法观察大鼠肺部病理变化;ELISA法检测大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;透射电镜观察肺脏中的自噬小体;Western blot法检测大鼠肺脏P62、LAMP1、TFEB核质蛋白的蛋白表达及自噬微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）蛋白表达的比值。 结果:1.CSE以浓度依赖性的方式抑制了 NR8383细胞的活力（P＜0.05,P＜0.01）。与24h相比，48h组、72h组细胞活力显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;且48h组与72h组无显著性差异（P＜0.05）。CSE处理24h后，细胞存活率良好，因此，选择24h作为CSE干预时间。 2.CSE诱导NR8383细胞自噬受损，引发炎症反应。Western blot结果显示，在24 h时间段，CSE浓度依赖性促进自噬底物降解蛋白P62的蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比值（P＜0.05,P＜0.01，P＜0.001）;对照组细胞中自噬小体数量较少;CSE刺激后NR8383细胞内自噬体数量增多。与对照组相比，CSE组NR8383细胞溶酶体表面膜蛋白LAMP1荧光强度显著降低（P＜0.01）;Lyso-Tracker Red探针红色荧光强度明显降低（P＜0.01）;细胞上清液中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌明显增多（P＜0.001）。与对照组相比，CQ组P62蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值明显增加（P＜0.01）;上清液中以上炎性因子水平明显提高（P＜0.001）。自噬激活剂Rapamycin部分逆转CSE诱导的NR8383细胞炎性因子的分泌（P＜0.01）。 3.CSE通过抑制TFEB入核诱导NR8383细胞炎症反应。与对照组相比，CSE组TFEB入核减少（P＜0.01，P＜0.001）。使用TFEB诱导剂fisetin预处理NR8383细胞，结果发现，与CSE组相比，CSE+fisetin组P62蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值均下降（P＜0.05）;溶酶体表面膜蛋白LAMP1荧光强度增强（P＜0.05）;Lyso-Tracker Red 探针红色荧光增强（P＜0.05）;上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著下降（P＜0.001）。 4.烟熏12周结束后，与正常组相比，COPD大鼠用力肺活量（FVC）、第0.1秒用力呼气量（FEV0.1），第0.3秒用力呼气量（FEV0.3）、FEV0.1与FVC比值（FEV0.1/FVC）、FEV0.3与FVC比值（FEV0.3/FVC）明显下降（P＜0.001）;大鼠肺间隔增厚，炎性细胞广泛浸润;BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量明显增多（P＜0.001）;肺组织内自噬小体丰富;肺组织内TFEB免疫阳性表达显著减少（P＜0.001）;自噬相关蛋白P62蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达比值均有显著增高，而LAMP 1的蛋白表达水平及TFEB核质比明显降低（P＜0.001）。 5.相较于模型组，模型+电针组大鼠肺功能指标均有所提高（P＜0.001）;肺泡壁轻度增厚，肺组织炎性浸润有所改善;BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量显著下降（P＜0.001）;肺组织内自噬小体数量较少;肺组织内TFEB免疫阳性表达明显增多（P＜0.05）;P62蛋白水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白比值明显下降（P＜0.05,P＜0.001）,而LAMP1的蛋白表达水平及TFEB核质比明显增多（P＜0.01）。 6.最后四天予以大鼠腹腔注射自噬抑制剂CQ。与模型组比较，模型+CQ组大鼠肺功能指标均显著下降（P＜0.001）;肺泡壁增厚，肺泡腔扩大，炎性细胞浸润明显;BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量有所升高（P＜0.05）;自噬相关蛋白P62的表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比值有所升高（P＜0.001），而LAMP1则明显下降（P＜0.05）。 7.予以大鼠腹腔注射自噬抑制剂CQ,与模型+电针组相较，模型+CQ+电针组大鼠的上述指标均有一定程度的逆转（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。 结论:1.CSE抑制TFEB入核诱导NR8383细胞自噬受损。 2.单纯香烟烟熏法建立的COPD模型大鼠的肺组织病理学变化及肺功能下降等特点与COPD患者相似，本研究成功制备COPD模型大鼠。 3.电针能有效改善COPD大鼠肺功能，减轻肺部炎症，电针对于COPD有着较好的治疗效果。 4.香烟烟雾会引发COPD大鼠肺组织自噬受损，参与肺部炎症，这可能与其抑制TFEB入核有关。 5.电针能改善COPD大鼠肺组织自噬受损，减轻肺部炎症，改善肺功能;其可能与电针促进TFEB入核有关。
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