摘要
胆汁淤积是胆汁分泌和排泄障碍引起的胆汁成分如胆汁酸、胆固醇和胆红素在肝脏和体循环中过度积聚的病理生理过程。胆汁淤积性肝病约占成人肝移植的9％,占儿童肝移植的43％。当前，对于胆汁淤积性肝脏疾病，临床常用药物为熊去氧胆酸(UDCA)或法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)激动剂奥贝胆酸( OCA)等，但副作用较多，急需探索新型、安全的抗胆汁淤积性肝病的治疗药物。栀子是茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，具有清热利湿功效，栀子多糖(Gardenia jasminoides Ellis polysaccharide,GPS)是栀子的主要活性成分之一。本课题组前期研究发现GPS干预能显著减轻α-萘异硫氰酸酯(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)诱导的胆汁淤积性肝损伤，作用与其调节肠道菌群，诱导肝脏核受体FXR表达，促进胆汁酸的代谢及外排等有关，但具体机制尚不清楚，值得深入研究。 目的: 本课题运用ANIT诱导的急性胆汁淤积小鼠模型及细胞实验，探索GPS肠菌代谢产物激活FXR的肝保护作用及作用机制，为GPS抗胆汁淤积性肝损伤的应用与开发提供依据。 方法: 1.采用单因素试验和三因素三水平的正交实验设计方法，优化GPS的制备工艺;利用高效液相凝胶色谱法、气质联用法、红外光谱及扫描电镜等检测方法对GPS进行结构表征。 2.运用ANIT诱导的小鼠急性胆汁淤积模型，考察GPS给药2周对模型小鼠肝功能指标和肝脏组织形态学的影响，运用免疫组化、western blot等方法观察GPS对小鼠肝脏巨噬细胞(F4/80+)、中性粒细胞(Ly6G+)细胞浸润及炎症因子表达的影响，考察GPS对胆汁淤积小鼠肝脏炎症的影响。 3.采用超高效液相串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，测定小鼠血清、胆汁、粪中多种胆汁酸水平以及GPS干预后对胆汁酸稳态的调节作用。 4.运用UPLC-LTQ-Orbitrap技术，利用代谢组学方法研究GPS对急性胆汁淤积小鼠体内代谢轮廓及代谢物的影响，研究GPS影响的代谢物及代谢通路，探索GPS抗急性胆汁淤积性肝损伤的代谢调节机制。 5.利用GC-MS/MS技术测定GPS体内给药、体外培养的肠菌代谢产物的变化，采用双荧光素酶报告基因方法，观察肠菌代谢产物丁酸对FXR核转录活性的影响。 6.运用ANIT诱导的小鼠急性胆汁淤积模型，观察丁酸钠及丁酸钠加FXR抑制剂对胆汁淤积性肝损伤的影响。运用免疫组化方法观察小鼠肝脏巨噬细胞( F4/80+)以及中性粒细胞(Ly6G+)细胞浸润的影响，考察丁酸钠的抗炎效果，利用免疫荧光法观察丁酸钠对胆汁淤积小鼠肠粘膜屏障功能的影响，采用UPLC-MS/MS考察丁酸钠对胆汁淤积小鼠胆汁酸稳态的影响，采用实时荧光定量 PCR考察丁酸钠对胆汁酸调控通路相关的肝脏核受体、代谢酶、转运体及炎症通路表达的影响。 结果: 1.以多糖提取率为评价指标，基于单因素试验的结果，采用正交实验优化了GPS制备工艺，其中提取温度对GPS的影响最显著，最终筛选出GPS的最佳制备工艺为:提取3次，料液比1∶20，提取时间3 h,提取温度100℃，醇沉浓度70％乙醇为最佳提取工艺。阐明了 GPS分子量、总糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量、单糖组成、红外光谱、表面形貌等结构特征。 2.给药2周后，GPS可显著降低胆汁淤积小鼠血清ALT、AST、TBA、ALP、DBIL及TBIL等血生化水平，改善ANIT诱导的胆汁淤积小鼠肝细胞坏死、炎症细胞浸润等病理损伤，减轻肝组织浸润的巨噬细胞和中性粒细胞表达，下调炎症因子的表达，抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路。 3. GPS干预后改变了胆汁酸池的结构和组成，降低血清中毒性胆汁酸LCA和DCA的浓度，同时也显著降低了 TCA和T-β-MCA等结合型胆汁酸水平，促进了游离胆汁酸尤其是DCA和LCA以及结合型胆汁酸TCDCA、TLCA、GCA和GHDCA等向胆囊的分泌，促进了胆汁酸经粪的排泄，尤其是促进了 DCA、LCA、MCA、TCA和T-β-MCA的排泄，逆转了胆汁酸稳态的紊乱。 4.代谢组学分析表明GPS的抗胆汁淤积性肝损伤作用可能与其调节胆汁酸合成、鞘脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢途径有关。 5.采用GC-MS/MS分析技术测定了 GPS给药后体内、体外培养后的肠菌代谢物，发现丁酸是GPS干预后发生变化最主要的肠菌代谢产物，双荧光素酶报告基因发现丁酸钠可显著激活核受体FXR的转录活性。 6.采用ANIT诱导的小鼠急性胆汁淤积动物模型，发现丁酸钠可显著改善胆汁淤积小鼠胆汁酸稳态紊乱、修复肠粘膜屏障、抑制肝脏TLR4/NF-κB炎症通路，缓解肝脏炎症减轻肝脏损伤，而FXR抑制剂干预对抗了丁酸钠的肝保护作用。 结论: GPS能改善ANIT诱导的急性胆汁淤积性肝损伤，其作用环节可能与促进肠菌主要代谢产物丁酸生成，诱导FXR表达及转录活性，上调胆汁酸外排转运体表达，改善胆汁酸稳态紊乱，修复肠粘膜屏障及抑制肝脏TLR4/NF-κB炎症通路有关。
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