摘要
目的：1.探究糖尿病肾病（diabetickidneydisease，DKD）中肾组织肝再生增强因子（augmenterofliverregeneration，ALR）下调对肾小管上皮-间充质转分化（epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT）相关因子的影响。2.研究ALR可能通过调控TGFβ/Smad信号通路加重DKD的纤维化。 方法：①DKD小鼠模型建立后，检测各组小鼠24小时尿蛋白定量和尿蛋白肌酐比值；对肾脏进行病理切片后染色，苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining，HE）和过碘酸希夫染色（periodicacid-Schiffstaining，PAS）观察各组肾组织形态结构的变化及肾小管损伤情况；Masson染色观察各组纤维化的情况；电镜下观察足细胞足突和基底膜情况；②DKD模型建立成功后，注射ALR敲低腺相关病毒和空载病毒，采用免疫组化、蛋白印迹技术（Westernblot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timepolymeraseChainReaction，Real-timePCR）技术检测ALR敲低情况。③验证ALR在DKD中敲低成功后，免疫组化、Westernblot、q-PCR方法检测各组EMT相关特异性标记蛋白，如E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、α-SMA的表达情况；DHE（dihydroethidium)染色和TUNEL染色分别观察各组小鼠活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）和凋亡情况。④q-PCR和Westernblot方法检测TGFβ/Smad信号通路分子，如TGF-β1、Smad3、Smad7的表达水平。⑤实验分组：正常对照组（Control组）、糖尿病肾病组（DKD组）、ALR下调组（DKD+ALRsiRNA）、空载病毒组（DKD+NCsiRNA）。 结果： 1.糖尿病肾病小鼠模型的构建 2型糖尿病小鼠模型建造成功后，继续高脂饮食喂养8周后代谢笼收集24小时尿液，检测各组别24小时尿白蛋白含量，DKD组与Control组相比，24小时尿蛋白含量明显增加（Plt;0.001）。 2.成功构建糖尿病肾病小鼠肾组织中ALR下调模型 通过腺相关病毒局部注射的方法成功构建糖尿病肾病小鼠ALR下调模型，并应用Westernblot、q-PCR、免疫组化方法，与DKD组和DKD+NCsiRNA组进行对比（Plt;0.05），验证ALR在DKD+ALRsiRNA组中小鼠肾组织终被成功下调。 3.不同组别小鼠肾组织病理染色 HE、PAS染色结果发现，正常组小鼠肾组织肾小球和肾小管结构清晰。DKD组及DKD+NCsiRNA组出现轻度损伤，DKD+ALRsiRNA组肾小球和肾小管损伤最严重，Masson染色中，Control组基本无纤维化发生，DKD组及DKD+NCsiRNA组出现轻度纤维化，DKD+ALRsiRNA组纤维化最严重。且HE、PAS、Masson染色中，其余三组与Control组相比，均有统计学差异（Plt;0.05），DKD组与DKD+NCsiRNA组之间无统计学差异（Pgt;0.05）. 4.DKD小鼠肾组织中ALR下调与肾小管EMT变化 Westernblot、Real-timePCR和免疫组织化学染色结果显示，各组小鼠肾组织中N-Cadherin、Vimentin、α-SMA、Caspase3的表达水平在Control组中最低，DKD+ALRsiRNA组最高，DKD组与DKD+NCsiRNA组无差异，但均高于Control组,低于DKD+ALRsiRNA组（Plt;0.05）。小鼠肾组织中E-Cadherin的表达水平在Control组中最高，DKD+ALRsiRNA组中最低，DKD组与DKD+NCsiRNA组之间无差异，但均低于Control组，高于DKD+ALRsiRNA组（Plt;0.05）。 5.ALR下调与TGFβ/Smad通路 Westernblot结果表明，与Control相比，DKD组、DKD+ALRsiRNA组、DKD+NCsiRNA组小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达水平显著增高（Plt;0.05）,其中DKD+ALRsiRNA组升高最为明显，DKD组与DKD+NCsiRNA组表达水平无差异（Pgt;0.05）；Smad7蛋白表达水平在Control组小鼠肾组织中最高，而在DKD组、DKD+ALRsiRNA组、DKD+NCsiRNA组中表达显著下降（Plt;0.05），DKD+ALRsiRNA组下降最为明显，DKD组与DKD+NCsiRNA组表达水平无差异（Pgt;0.05）。 6.ALR下调对DKD小鼠肾组织肾小管氧化应激和细胞凋亡的影响 通过DHE和TUNEL染色，我们发现，与Control相比，DKD组、DKD+ALRsiRNA组、DKD+NCsiRNA组小鼠肾组织中ROS水平表达显著升高和凋亡加重，其中DKD+ALRsiRNA组最高，而DKD组与DKD+NCsiRNA组表达水平无差异。 结论： 1．敲低DKD小鼠肾组织中ALR表达后升高了DKD小鼠的血糖水平，加重了肾脏EMT的水平。 2．ALR可能通过TGF-β/Smad通路促进DKD小鼠肾脏发生EMT,加重DKD的进展。 3.ALR的敲低促进DKD小鼠肾组织中ROS的产生，加重细胞凋亡。
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