摘要
肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化和肝癌所必须经历的共同病理过程，主要表现为肝星状细胞活化、细胞外基质过度沉积、汇管区大量纤维结缔组织异常增生，及多种炎性因子和趋化因子释放。目前临床上针对肝纤维化的诊疗手段相对有限，深入研究肝纤维化发生发展的分子机制和病理生理过程尤为重要。 近年来随着高通量测序检测技术的发展，人们已证实在肝脏、肌肉、心脏等不同组织和细胞中mRNA存在广泛m5C修饰，为mRNAm5C甲基化研究提供了有力的数据支持。RNA甲基转移酶NSUN2,作为催化mRNA内部m5C修饰的关键酶，通过介导靶标mRNAm5C甲基化修饰调控mRNA的细胞定位、稳定性及其蛋白翻译。已知NSUN2在肿瘤的增殖与迁移，阿尔茨海默病等多种疾病过程中发挥重要作用，但NSUN2介导的mRNAm5C甲基化修饰是否参与肝纤维化等肝脏相关疾病的发生发展仍无报道，亟待探讨。本文利用肝脏组织NSUN2基因特异性敲除小鼠探讨了NSUN2在肝纤维化发生发展中的作用及其分子机制，并得到以下结论: (1)NSUN2全身敲除小鼠(NSUN2-/-)繁育数量低(仅获得1只)，体型小。NSUN2杂合敲除小鼠(NSUN2+/-)繁育符合孟德尔规律，体型正常。与WT小鼠相比，NSUN2+/-小鼠的肝脏、心脏和肌肉组织中NSUN2蛋白表达水平均降低一半左右，NSUN2-/-小鼠的肝脏、心脏和肌肉组织中未检测到NSUN2蛋白表达。尽管NSUN2-/-小鼠构建成功，但由于数量少，无法进行后续研究。 (2)肝脏实质细胞NSUN2基因特异性敲除小鼠(NSUN2flox/flox/Alb-Cre,LKO)整体发育正常，血液生化指标及肝功能正常。与对照小鼠(NSUN2flox/nox,WT)相比，NSUN2LKO小鼠肝脏组织中NSUN2蛋白表达水平显著下降，而心脏、肺、大脑中NSUN2蛋白表达水平未见改变，且NSUN2LKO小鼠基因型鉴定正确，NSUN2LKO小鼠构建成功。 (3)利用CCl4诱导NSUN2LKO小鼠和WT对照小鼠建立肝纤维化模型，与WT+CCl4组小鼠相比，NSUN2LKO+CCl4组小鼠血清ALT和AST水平显著降低，肝脏组织中肝纤维化标志物α-SMA和Col1α1、TIMP-1和TGF-β表达水平显著下降，免疫因子IL-6、IL-1β、TNF-α和趋化因子CCL2mRNA水平显著降低，巨噬细胞表面标志物F4/80和CD68表达水平显著降低;肝脏组织H&E染色可见肝脏组织结构损伤减轻，巨噬细胞浸润减少;肝脏组织Masson染色和SiriusRed染色可见胶原沉积减少,NSUN2缺失缓解了CCl4诱导的小鼠肝纤维化表型。 (4)在人肝实质细胞L02中，RNA甲基转移酶NSUN2能够与自分泌因子ATXmRNA直接相互作用，促进ATX蛋白表达，进而增加CCL2mRNA水平，促进CCL2蛋白表达。NSUN2-ATX-CCL2调控通路可能是NSUN2参与肝纤维化发生发展的分子机制之一。 (5)RNA结合蛋白YBX1、YBX3和ANXA2均不是NSUN2介导ATXmRNAm5C甲基化修饰的阅读蛋白。 综上所述，由于未获得足量NSUN2基因纯和敲除小鼠，我们构建了肝脏实质细胞NSUN2基因特异性敲除小鼠，并利用该基因敲除小鼠建立CCl4诱导的肝纤维化模型，初步探究NUSN2在小鼠肝纤维化发生发展中的作用及其分子机制。与发生肝纤维化的WT小鼠相比，NSUN2缺失降低了肝纤维化小鼠血清中ALT和AST水平，减轻了小鼠肝脏组织中a-SMA和IL-6等肝纤维化相关因子及免疫因子的表达，缓解了CC14诱导的小鼠肝纤维化表型。且NSUN2-ATX-CCL2调控通路可能是NSUN2介导的mRNAm5C甲基化参与肝纤维化发生发展的分子机制之一。本研究从mRNA表观修饰角度阐释NSUN2在肝纤维化发生发展中的作用，不仅拓展了RNA甲基转移酶NSUN2的生物学功能，也为肝纤维化的发病机制研究提供了新线索。
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