摘要
目的： 本研究综合运用钙信号、化学遗传学、病毒示踪的方法，观察七氟烷全身麻醉后对脚桥被盖网状核(Pedunculopontinetegmentalnucleus,PPTg)胆碱能(Cholinergic,ChAT)神经元的影响，探究PPTgChAT在七氟烷全身麻醉中的作用机制。 方法： 1.钙信号：选取成年健康雄性ChAT-Cre小鼠6只，体重20-25g。使用2.4%七氟烷混合氧气(1.5L/min)对小鼠进行麻醉，抽取病毒AAV-hSyn-GCaMP6m，缓慢注入小鼠单侧PPTg区域。将光纤陶瓷插芯放置在注射部位上方100μm处，待病毒转染21天，使用多通道光纤钙信号记录系统对七氟烷全身麻醉后的小鼠PPTg区域GCaMP6m的荧光信号进行记录。最后，脑区切片荧光染色，验证病毒转染情况； 2.化学遗传学：选取ChAT-Cre小鼠18只，随机分为3组(n=6)，分别为激动组(AAV-EF1α-DIO-hM3Gq-eYFP)、抑制组(AAV-EF1α-DIO-hM4Gi-eYFP)以及空白对照组(AAV-EF1α-DIO-eYFP)，同上述方法，定位PPTg脑区，双侧PPTg脑区注入相应的病毒，用七氟烷全身麻醉小鼠后，向其腹腔内注入CNO/生理盐水，选择性激动或抑制PPTgChAT神经元，同时记录了翻正反射消失(Lossofrightingreflex,LORR)、翻正反射恢复(Resumptionofrightingreflex,RORR)时间以及皮层脑电图(Electroencephalography,EEG)，并进行分析，最后将切片的脑区进行c-fos染色，验证病毒转染情况； 3.病毒示踪：选取ChAT-Cre小鼠6只，双侧PPTg脑区处注射示踪病毒，待病毒转染3周后，切片观察带荧光的核团，明确PPTgChAT神经元投射位置。 结果： 1.钙信号结果显示，ChAT-Cre小鼠在七氟烷麻醉后引起LORR时，钙信号活性明显下降(Plt;0.01)，而在停药后RORR时钙信号活性逐渐升高(Plt;0.001)。 2.化学遗传学结果显示，与对照组相比，化学遗传学抑制ChAT神经元，显著减少了LORR时间(Plt;0.05)，增加了RORR时间(Plt;0.05)，同时EEG显示在LORR期δ波(1-4HZ)增加(Plt;0.01)，γ波(25-60HZ)减少(Plt;0.05)，在RORR期δ波(1-4HZ)增加(Plt;0.05)和γ波(25-60HZ)减少(Plt;0.05)，激活ChAT神经元，显著增加LORR时间(Plt;0.05)，减少LORR时间(Plt;0.05)，EEG显示在LORR期δ波(1-4HZ)减少(Plt;0.001)和γ波(25-60HZ)增加(Plt;0.05)，同时在RORR期δ波(1-4HZ)减少(Plt;0.01)和γ波(25-60HZ)增加(Plt;0.05)。 3.病毒示踪结果显示，在PPTg处注射顺行示踪病毒(AAV-hSyn-hChR2-EYFP)后，发现在大脑脚(Cerebralpeduncle,CP)、丘脑腹侧核(Ventralnucleusofthalamus,VENT)处存在投射。 结论： 1.PPTgChAT神经元参与调控七氟烷麻醉的诱导，在致意识改变中具有促觉醒作用； 2.在PPTg处注射光遗传病毒后，在CP、VENT处存在投射。
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