摘要
研究发现D-氨基酸分别以游离态和结合态的形式存在于生命体的不同部位，并担负着一定的生理功能，但是其过量表达往往会导致生理活动的紊乱，进而引发不同的疾病(如阿尔兹海默症、白内障、动脉粥硬化等)。其中，游离态的D-氨基酸在生理环境中可以蛋白酶系统(D-氨基酸氧化酶(DAAO)等)进行调控，但对于以结合态形式存在的含D-氨基酸多肽/蛋白质来讲，目前在研究中有相应的蛋白酶系统对其进行调控的报道很少。因此，为了在生理环境下通过蛋白酶系统有效地对含D-氨基酸多肽/蛋白质进行调控，本文以含10个氨基酸的多肽KYNETWRSED为模板，利用修饰策略对不同位点含D-氨基酸的多肽进行修饰，以此探究修饰后多肽的结构以及酶解性能的差异。具体的研究内容及结果如下所示: (1)以肽all-L (KYNETWRSED)及部分位点D-氨基酸取代的多肽(5-t(KYNEtWRSED),6-w (KYNETwRSED),7-r (KYNETWrSED)以及 5-t-6-w-7-r ( KYNEtwrSED))为原料，通过多肽固相合成法新合成了以C端PEG化为主以及部分N端PEG化的多肽，随后对比原料及前期N端PEG化多肽之间的性能异同点。 对实验中多肽的结构分析表明，PEG修饰前后多肽的CD吸收峰形仅有细微差别，并没有表现出明显的差异性，但是N端较C端PEG化会显著增强多肽在198 nm处的负的吸收峰信号强度。此外，由RP-HPLC分析发现在多肽的C端PEG化引发的极性减弱强于N端。通过对多肽的酶解分析表明N端PEG化可以显著促进与核心酶解位点相关的含D-氨基酸多肽在丝氨酸类蛋白酶作用下的酶解效率。利用高分辨液相色谱-质谱联用仪( LC-MS)分析发现PEG化并未改变大部分多肽的酶解位点。随后通过计算模拟解释了含D-氨基酸多肽的酶解促进很可能是由于PEG化增强了 PROK和多肽之间的相互作用力以及更为完善的催化三联体而造成的。因此，这一发现对清除含D-氨基酸多肽来维持正常的生理活动具有重要意义。 (2)以 all-L (KYNETWRSED)为对照，将肽 5-t (KYNEtWRSED)和 6-w( KYNETwRSED)作为研究对象，通过多肽固相合成法合成了 N端乙酰化的多肽。 通过CD分析发现N端乙酰化并未明显影响多肽的CD吸收峰的形状，但会在一定程度上增强多肽在198 nm处的负的吸收峰信号强度。而修饰后多肽在RP-HPLC 的保留时间延长说明了 N端乙酰化对多肽的极性具有减弱作用。对修饰前后多肽在PROK作用下的酶解分析可以看出，N端乙酰化对多肽的酶解具有明显的促进作用。并且N端乙酰化并未改变多肽的酶解位点。计算模拟分析发现完善的催化三联体以及增强的氢键相互作用力是酶解得以促进的主要原因。此外,就研究中所应用到的不同蛋白酶来讲，N端乙酰化修饰对丝氨酸类蛋白酶作用下的含D-氨基酸多肽的酶解具有促进作用。因此，这项工作说明了 N端乙酰化在含D-氨基酸多肽的酶解促进中具有一定的应用价值。 (3)以肽 5-t ( KYNEtWRSED)为模型肽，并以 all-L (KYNETWRSED)为对照，通过多肽固相合成法将8种不同的单糖共价连接到多肽中，以此来对比分析糖基化对多肽的结构和酶解影响。 结构分析表明糖基化修饰前后多肽的CD吸收峰的形状未发生明显改变，但与PEG化和N端乙酰化不同的是，糖基化在不同程度上减弱了多肽在198 nm处负的吸收峰信号强度。糖肽在RP-HPLC的保留时间变短说明了糖基化会增强多肽的极性，且不同单糖的修饰对多肽的极性增强也表现出差异性。通过对PROK作用下的酶解分析发现糖基化抑制了肽5-t的酶解。然而，当糖肽与糜蛋白酶共孵育时，结果呈现出除了乙酰氨基半乳糖的修饰外，其它不同的糖基化修饰对5-t的酶解具有促进作用，且糖基化并未改变多肽的酶解位点。通过分子对接解释了酶促作用可能是由于糖肽与糜蛋白酶之间的增强的氢键和静电相互作用而引起的。因此，这些发现有助于更好地了解糖基化策略在多肽的酶学稳定性方面的应用。 以上研究结果表明:与正常肽相比，对含D-氨基酸的多肽进行PEG化、N端乙酰化以及糖基化修饰后在不同蛋白酶作用下对其酶解有着不同寻常的影响，这有助于认识不同修饰策略对含D-氨基酸多肽的酶解稳定性的影响机制。
NETL