摘要
研究目的 本实验通过构建间充质干细胞（MSC）与乳腺癌细胞的共培养体系，模拟癌细胞与间质细胞的肿瘤微环境，探究三黄煎剂是否能够通过减少肿瘤微环境中的趋化因子CXCL8,抑制共培养体系中乳腺癌细胞的转移。 研究方法 1.用TNF-α刺激间充质干细胞，Elisa检测TNF-α影响间充质干细胞分泌炎性趋化因子CXCL8、CCL2的情况。 2.构建间充质干细胞与MDA-MB-231、MCF-7细胞的共培养体系，划痕实验、Transwell侵袭实验检测间充质干细胞对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响;WesternBlotting实验检测间充质干细胞对乳腺癌细胞上皮间质转化（EMT）相关蛋白的表达影响。 3.siCXCL8转染TNF-α刺激后的间充质干细胞，通过qPCR和Elisa实验检测转染效率。 4.MTT实验筛选三黄煎剂干预TNF-α刺激的间充质干细胞的最佳浓度和时间，并用Elisa实验检测三黄煎剂干预间充质干细胞后，其CXCL8的表达水平。 5.划痕实验、Transwell侵袭实验检测三黄煎剂对共培养体系中MDA-MB-231、MCF-7细胞迁移、侵袭的影响;WesternBlotting实验检测三黄煎剂对共培养体系中乳腺癌细胞EMT相关蛋白的表达影响。 6.运用网络药理学探索三黄煎剂与乳腺癌之间的交集靶点，构建蛋白互作（PPI）网络,并对交集靶点进行GO富集分析与KEGG通路分析。 研究结果 1.10ng/mLTNF-α刺激MSC6小时后，CXCL8的表达量显著升高，是control组的10倍以上。MSC本身分泌的CCL2小于CXCL8,虽然在TNF-α刺激后较之前有所升高，但其增加量远不及CXCL8。 2.划痕实验、Transwell侵袭实验证明MDA-MB-231、MCF-7细胞与MSC共培养后，其迁移和侵袭能力显著强于单独培养时。当MSC经过TNF-α刺激后，能诱导MCF、MDA-MB-231产生更强的迁移和侵袭效应。 3.WesternBlotting实验证明MSC能下调MDA-MB-231细胞中E-cadherin蛋白表达，上调MMP9、MMP2、Vimentin蛋白表达。类似的，与MSC共培养后，MCF-7细胞的E-cadherin蛋白表达下降，MMP9、Vimentin蛋白表达上升，MMP2虽然比单独培养组表达略高，但无统计学意义。经过TNF-α刺激后的MSC分别与MDA-MB-231、MCF-7共培养，两种乳腺癌细胞都展现了更强的上皮间质转化能力，转移能力进一步增强。 4.通过siRNA法转染TNF-α刺激后的MSC,qPCR实验证明MSC中CXCL8mRNA表达显著降低，转染效率达到85.2％;Elisa实验证明MSC分泌的CXCL8量减少，转染效果较好。 5.不同浓度的三黄煎剂(1、2、4、8、12、16、20mg/mL)分别处理MSC24小时、48小时、72小时，MTT实验筛选干预的最佳浓度和时间。研究发现在各个时间点，MSC的生存率随着三黄煎剂浓度的升高而下降，具有明显的浓度依赖性。三黄煎剂对于MSC作用24小时、48小时、72小时的IC50值依次为11.84mg/mL、8.22mg/mL、5.03mg/mL。 6.Elisa法检测11.84mg/mL三黄煎剂干预MSC24小时、8.22mg/mL三黄煎剂干预48小时、5.03mg/mL三黄煎剂干预72小时后各组的CXCL8表达量，发现不同浓度的三黄煎剂均能降低MSC来源的CXCL8。CXCL8在经过8.22mg/mL三黄煎剂处理48小时后，明显低于11.84mg/mL三黄煎剂处理24小时后的表达量，5.03mg/mL三黄煎剂干预72小时后，CXCL8的表达量略低于48小时，但与48小时相比，没有统计学意义。因此，后续实验选用8.22mg/mL三黄煎剂干预MSC48小时。 7.划痕实验和Transwell实验检测不同处理组的MDA-MB-231细胞迁移、侵袭情况。当CXCL8被敲减后，MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移率和侵袭率比co-MSC-TNF-α组显著降低，也比单纯培养的control组的转移能力弱。三黄煎剂干预后，进一步降低了乳腺癌细胞的迁移率，展现了比siCXCL8更强劲的抑制迁移、侵袭作用。另外，研究还发现，虽然乳腺癌细胞与TNF-α-MSC共培养后，其迁移能力比单纯培养组更强，但是经过siCXCL8或者三黄煎剂干预后，此时的乳腺癌细胞迁移能力比单独培养时更弱。 8.WesternBlotting实验证明CXCL8敲减后，共培养体系中的MDA-MB-231、MCF-7细胞中MMP9和Vimentin表达比co-MSC-TNF-α组显著下降。三黄煎剂干预后，进一步下调乳腺癌细胞中MMP9和Vimentin的表达，并且siCXCL8或者三黄煎剂干预后，MMP9和Vimentin的表达还显著低于单独培养时的乳腺癌细胞。siCXCL8和三黄煎剂能上调E-cadherin的表达，且三黄煎剂对于E-cadherin的上调效应强于siCXCL8。实验还发现，siCXCL8上调共培养体系中乳腺癌的E-cadherin表达与单独培养组的没有明显差异(P＞0.05)，而三黄煎剂组的E-cadherin则明显高于单独培养组。 9.网络药理学验证三黄煎剂可以多靶点、多通路抑制乳腺癌进展，其中包括CXCL8这一靶点。 研究结论 肿瘤微环境中的间充质干细胞能促进乳腺癌的迁移侵袭和EMT进程，并且趋化因子CXCL8发挥促进作用，三黄煎剂的干预能够减少旁分泌的趋化因子CXCL8,抑制共培养体系中乳腺癌细胞的迁移侵袭和EMT进程。
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