摘要
目的:本实验通过针刀干预治疗颈型颈椎病模型兔，观察针刀干预后颈型颈椎病模型兔劳损颈肌及椎间盘形态学改变，探讨针刀通过Wnt/β-catenin信号通路调控Wnt3、β-catenin、c-Myc和MyHC1等含量变化，促进颈型颈椎病模型兔受损颈肌修复的机制研究。以期为临床运用针刀治疗颈型颈椎病提供实验支持。 方法:共选取33只6月龄的清洁级雄性新西兰兔，按随机数字表法将其分为空白组、模型组、针刀组3组，每组11只。模型组与针刀组采用长期“低头位”方法，将兔固定于自行设计的低头位颈椎病造模盒中，使其呈低头屈曲体位，空白组同步抓取，由颈椎侧位X线片判断造模是否成功。造模结束后第2天，对针刀组进行干预，以针刀治疗四步法为参考，选取颈夹脊穴为治疗点，每周一次，共进行4次。干预结束后一周取材。采用HE染色法观察各组兔颈部肌肉及椎间盘组织形态学变化;Masson染色法观察兔颈肌中纤维组织增生程度;免疫组化法检测肌肉组织中MyHC的比例及分布;WesternBlot法和实时荧光定量PCR法(q-PCR)检测肌肉组织中Wnt3、β-catenin、c-Myc及MyHC1蛋白含量及基因表达程度的变化。 结果: 1.一般情况:空白组状况良好，精神活泼，饮食摄水量无明显变化，二便正常，体重增长稳定，颈部活动自如，触诊颈部肌肉松软，无明显结节或条索出现。模型组精神状况一般，饮食摄水量减少，小便正常，大便量可，偶有稀便，体重增长缓慢，颈部活动略显僵硬，常出现甩头、后爪挠脖子的行为。触诊颈部肌肉紧张、僵硬，可触及条索状结节。针刀组精神状况可，饮食摄水量正常，二便正常，体重增长较稳定，颈部活动自如，触诊颈部肌肉较松软，偶可触及结节，体积较小。 2.颈部X线摄片情况:空白组颈椎侧位X线摄片示:颈椎生理曲度正常，其顺列呈缓和、连续的生理前凸弧线，未见骨质增生、骨刺形成及附着韧带肥厚钙化等情况。模型组颈椎侧位X线摄片示:颈椎生理曲度明显改变，椎间隙变窄，椎间孔缩小，未见明显骨质增生、骨刺形成及附着韧带肥厚钙化等情况。针刀组颈椎侧位X线摄片示:颈椎生理曲度略有改变，椎间隙轻微变窄，椎间孔缩小不明显。 3.彩色多普勒超声摄片情况:空白组颈部肌肉结构完整，肌束连续，血流信号呈点状分布。模型组颈部肌肉结构完整性破坏，肌肉组织回声增强，肌束膜和肌内结缔组织回声断续，回声信号偏高，血流信号丰富，由点状融合成片状。针刀组颈部肌肉结构较完整，肌束膜连续，血流信号呈点状分布。 4.颈多裂肌HE染色结果:空白组多裂肌横截面肌细胞形态规则饱满、细胞核分布均匀，细胞间间隙规则紧密。纵切面肌纤维排列紧密、均匀，形态规则。模型组多裂肌横截面肌细胞呈不规则异形，细胞核分布改变，细胞间间隙不规则且紊乱，肌细胞水肿并有炎性细胞浸润。纵切面肌纤维呈梭形聚集，相间出现变细、萎缩、断裂和扭曲样改变的肌纤维，少量淤血，炎性细胞浸润明显。针刀组多裂肌横截面肌细胞呈较规则多边形，细胞较饱满，细胞核分布改变，细胞间间隙规则且排列紧密，部分肌细胞水肿。纵切面肌纤维排列稍规则，少量梭形聚集结构以及断裂、扭曲样改变，少量炎性细胞浸润。 5.颈椎间盘HE染色结果:空白组可见正常软骨组织结构，髄核内细胞数量较多，纤维环胶原纤维分层排列整齐，髓核与纤维环界限清楚。模型组可见髓核内细胞数量较少，可见钙化软骨层和透明软骨层之间潮线分布，纤维环胶原纤维排列较整齐，少量纤维环胶原纤维分层。针刀组可见正常软骨组织结构，髓核细胞较多，结构尚完整，纤维环胶原纤维排列较整齐，少量纤维环胶原纤维分层。 6.颈多裂肌Masson染色结果:空白组可见大量红色染色的肌纤维，少许蓝色染色的纤维组织增生区域。模型组可见红色染色的肌纤维形状呈扭曲样改变，出现大量蓝色染色的纤维组织增生部分。针刀组可见大量红色染色的肌纤维，有蓝色染色的纤维组织增生部分出现。 7.WB法检测颈多裂肌蛋白含量结果:与空白组相比，模型组颈肌中Wnt3、β-catenin、c-Myc、MyHC1蛋白相对表达量均明显降低(P＜0.05);与模型组相比，针刀组颈肌中Wnt3、β-catenin、c-Myc、MyHC1蛋白相对表达量均明显升高(P＜0.05)。 8.q-PCR法检测颈多裂肌中基因表达结果:与空白组相比，模型组颈肌中Wnt3、β-catenin、c-Myc、MyHC1mRNA相对表达量均明显降低(P＜0.05);与模型组相比，针刀组颈肌中Wnt3、β-catenin、c-Myc、MyHC1mRNA相对表达量均明显升高(P＜0.05)。 9.免疫组化法检测颈多裂肌中MyHC表达结果:与空白组相比，模型组颈肌中MyHC表达减少(P＜0.05);与模型组相比，针刀组颈肌中MyHC表达明显增加(P＜0.05)。 结论: 1.本实验采取的“低头位”制作颈椎病模型的方式具有可行性。 2.针刀干预治疗颈椎病在一定程度上可以促进颈部肌肉组织的修复，减轻水肿、炎症及淤血等情况，这可能是针刀缓解颈椎病患者颈部疼痛的机制之一。 3.针刀干预治疗颈型颈椎病的可能作用机制是通过促进Wnt/β-catenin信号通路活性实现的。针刀干预的机械刺激，促进了Wnt信号通路上游因子Wnt3、β-catenin的分泌，最终实现提高MyHC的基因表达及蛋白分泌，激活肌卫星细胞的活性，促进受损肌细胞的自我修复，最终达到恢复软组织的功能及力学平衡。
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