摘要
目的: 建立一种能够从乳腺癌(Breastcancer,BC)患者肿瘤组织中获得高纯度、并且能够稳定传代的原代细胞培养体系，利用原代细胞作为模型，探索临床化疗药物的敏感性，为BC患者的化疗效果临床前预测模型提供理论支持。 方法: 1.分离培养乳腺癌原代细胞:收集临床病理确诊为浸润性导管癌的乳腺癌患者肿瘤组织进行原代细胞分离培养，肿瘤组织来源于诊断性穿刺活检组织、手术切除组织以及新辅助化疗后残余肿瘤组织。分离出的原代细胞培养在BCMI培养基中，细胞贴壁生长后改用DMEM培养基继续培养。当细胞快速增殖，且在倒置显微镜下不见成纤维细胞，确定为高纯度肿瘤细胞后进行冻存。 2.验证乳腺癌原代细胞与其来源肿瘤组织具有同源性:(1)通过短串联重复序列(Shorttandemrepeat,STR)分析乳腺癌原代细胞基本保留了其来源组织的分子遗传学特性。(2)肿瘤组织苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining,HE)确定其乳腺癌组织学分型，免疫组织化学(Immunohisto-chemistry,IHC)检测乳腺癌肿瘤组织的特异性分子标记物如:雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(Progesteronereceptor，PR)、6人表皮生长因子受体2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)、肿瘤增殖抗原Ki-67、细胞角蛋白(Cytokeratin5/6，CK5/6)的表达情况，明确其分子分型。(3)乳腺癌细胞进行免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色，分析其ER、PR、HER2等分子标记物的表达情况。 3.验证乳腺癌原代细胞具有预测化疗药物疗效的潜力:(1)通过克隆形成实验对其集落形成能力进行验证，初步判断肿瘤细胞在体内的成瘤能力。(2)选择克隆形成实验中形成克隆数最多的乳腺癌原代细胞株，分别以5×103和5×104的细胞量各注入四只雌性裸鼠的第四脂肪垫以建立荷瘤小鼠模型，探究乳腺癌原代细胞在动物体内形成肿瘤所需要的最少细胞量。（3）根据其来源患者的临床化疗方案选择适当的化疗药物处理乳腺癌原代细胞后，通过传统的CCK-8细胞毒性实验和CellTiter-Glo细胞活性试验检测临床乳腺癌用药对乳腺癌原代细胞的抑制效果。 结果: 1.分离培养原代乳腺癌细胞:最终从18名乳腺癌患者的肿瘤组织中成功培养得到14株原代细胞。所培养的原代细胞贴壁生长，呈现出紧密相连的上皮表型，整个培养过程均未见明显的成纤维细胞。乳腺癌原代细胞培养成功的标准定义为:（1）细胞增殖超过六个月、冻存后能够复苏再生长;（2）原代细胞在一定程度上保留了原发肿瘤遗传学特征。在该标准下乳腺癌原代细胞的培养成功率达到77％。本实验成功建立了规模化的乳腺肿瘤原代细胞分离培养体系。 2.验证乳腺癌原代细胞与其来源肿瘤组织具有同源性:（1）进行了STR分析的六株乳腺癌原代细胞结果均显示:1）送检细胞不存在人源细胞系的交叉污染;2）送检细胞的STR数据与美国细胞培养物收藏中心（AmericanTypeCultureCollection,ATCC）数据库中的现存数据进行对比，其特征与目前的任何数据都不完全匹配，故所培养的乳腺癌原代细胞是全新的人源性细胞系。（2）HE染色确定乳腺癌肿瘤标本组织学分型均为浸润性导管癌，通过IHC明确了各位乳腺癌患者分子标记物ER、PR、HER2、Ki67、CK5/6的表达情况，确定了乳腺癌分子分型均为LuminalB型。(3)对六株原代细胞进行IF染色分析，结果显示原代细胞的ER、PR和HER2等标志蛋白的表达情况与其对应乳腺癌肿瘤组织的分子标记物表达情况相一致。 3.验证乳腺癌原代细胞具有预测药物疗效的潜力:（1）克隆形成实验结果显示:培养15天后，六株原代细胞形成的克隆数目和克隆大小各有不同，BC4#、BC5#、BC13#细胞的形成克隆的能力相近，强于其他三株细胞;BC3#细胞形成克隆的能力最弱。（2）裸鼠皮下荷瘤实验:注射5×103和5×104细胞量的两组裸鼠中，每组各有3只裸鼠形成皮下肿瘤，成瘤率均为75％。（3）分别用吡柔比星和多柔比星处理细胞，分析六株乳腺癌原代细胞对两种药物的半抑制浓度（Halfmaximalinhibitoryconcen-tration,IC50）,经不同药物处理、采用不同的活性检测试剂所得到的细胞IC50值不同。使用吡柔比星处理乳腺癌原代细胞，使用CellTiter-Glo试剂进行检测,BC3#细胞的IC50值最高，IC50=0.1739μm,而BC4#细胞的IC50值较低，IC50=0.007289μm，两株细胞的IC50数值相差达到23倍。再使用多柔比星处理细胞，CellTiter-Glo试剂进行检测，BC3#细胞的IC50值最高，IC50=1.764μm,而BC5#细胞的IC50值最低，IC50=0.004780μm,两株细胞的IC50数值相差达到369倍。 结论: 1.本研究建立了从BC患者不同来源的肿瘤组织中分离培养乳腺癌原代细胞的操作体系。 2.乳腺癌原代细胞在体外具有很强的增殖分裂的能力，同时还具有在裸鼠体内形成肿瘤的潜能。 3.乳腺癌原代细胞对相同药物处理后的反应有所不同，故认为乳腺癌原代细胞可以作为临床前模型预测BC患者对化疗药物的反应。
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