摘要
柑橘类水果因其丰富风味和富含维生素C等多种有益于健康的物质而深受消费者喜爱。果实酸度被认为是果实感官风味品质的重要构成成分，主要决定于柠檬酸、苹果酸和/或酒石酸的含量。通常情况下，柠檬酸被认为是柑橘类果实主要的有机酸，其次是苹果酸;果树叶片，梨和苹果等果实主要有机酸是苹果酸。迄今为止，柠檬酸积累调控机制在柑橘类果实中得到广泛研究，而苹果酸积累的分子调控机制则很少有报道。在本研究中，我们发现一个柑橘品种‘春香（Haruka）(Citrustamuranaxnatsudaidai）’在成熟期高积累苹果酸而低积累柠檬酸;另外，我们也发现在充足光照情况下柑橘果实中的苹果酸含量上升、柠檬酸含量下降。为了探究柑橘苹果酸积累调控机制，本研究全面比较了果实发育过程中的‘春香’和椪柑、柑橘叶片和果实、柑橘果实和梨果实、以及不同光照条件下果实的苹果酸和柠檬酸积累相关的基因表达;同时以柑橘、苹果果实或叶片，番茄等为材料，对得到的可能与苹果酸或柠檬酸变化相关的关键基因进行了转基因分析。主要研究结果如下: 1、通过对包括杂柑、甜橙类、宽皮柑橘类、柚类等不同柑橘（杂柑）果实的有机酸含量测定，发现杂柑‘春香’成熟果实积累较高的苹果酸、而柠檬酸含量比较低，与其它普通柑橘品种高柠檬酸、低苹果酸的有机酸谱明显不同。‘春香’果实中的苹果酸含量显著高于柠檬酸含量，前者是后者的1.5倍以上;同时‘春香’果实中的苹果酸含量显著高于其它常规柑橘苹果酸含量，前者是后者的2～3倍高。 2、通过BLAST分析，从柑橘基因组中发现了调节苹果酸的重要同源基因。其中柑橘只有1个基因编码苹果酸合成酶（MS）、苹果酸酶（ME）或富马酸水解酶（FUM），5个基因成员编码苹果酸脱氢酶（MDH），12个基因成员编码铝激活的苹果酸转运体（ALMT）。另外，只有MDH2、MDH3、CsALMT9-like和CsALMT9在柑橘果实汁囊中高表达。 3、系统比较了‘春香’和‘华柑2号’椪柑的果实在发育过程中的有机酸含量和苹果酸和柠檬酸积累相关基因的表达，结果发现:‘春香’果实中MS和CsALMT9-like的表达水平显著高于‘华柑2号’，可能是‘春香’果实中较高积累苹果酸的重要原因。此外，‘春香’果实CsCit和ACOs的转录水平显著高于‘华柑2号’，可能是其积累较低柠檬酸的重要原因。 4、全面分析了柑橘果实和叶片以及梨果实和叶片发育过程中的苹果酸含量以及苹果酸积累相关基因的表达，发现柑橘叶片中的CsALMT9-like表达水平随着苹果酸含量增加和升高，且显著高于果实;梨的ALMT9-like和ALMT9的表达水平均随叶片苹果酸含量增加而升高。结合相关性分析，认为CsALMT9-like的表达水平可能是决定柑橘果实和叶片苹果酸含量差异，或柑橘果实与梨果实苹果酸含量差异的重要因子。 5、在三个不同光条件组合体系（包括树冠外围顶部和树冠内膛、白天和黑夜、遮阴和不遮阴）中发现，充足光照显著调高苹果酸含量、降低柠檬酸含量。系统比较苹果酸和柠檬酸积累相关基因的表达，发现光照对苹果酸含量的影响与CsALMT9-like的表达水平密切相关，而与CsALMT9的表达水平关系不大;但是光照对柠檬酸含量的影响则与CsPH8的表达水平有关，而与CsCit的表达水平无关。另外，在CsALMT9-like上游3-kp的启动子区域也发现多个与光调控相关的顺式元件，间接支撑了CsALMT9-like在光调控果实苹果酸含量中的作用。 6、对可能的关键基因，包括CsALMT9-like，CsALMT9和CsCit进行了转基因功能验证。CsALMT9-like和CsALMT9都位于液泡膜上，分别构建了超表达和VIGS表达载体，在柑橘（春香和南丰蜜桔）、苹果（红富士）和Micro-Tom番茄的转基因分析表明:柑橘果实中苹果酸的积累主要与CsAMT9-like基因表达有关，与CsALMT9的表达关系不大，证实CsALMT9-like转录水平增加是‘春香’果实积累苹果酸的重要原因。而CsCit超表达载体和VIGS表达载体在‘春香’果实中的瞬时表达研究发现，CsCit超表达部位的柠檬酸含量显著下降，而CsCit的VIGS载体表达部位的柠檬酸含量显著增加，进一步证明CsCit的低表达是‘春香’果实汁胞中低积累柠檬酸的重要原因。 综合以上结果表明，‘春香’果实积累高苹果酸与CsALMT9-like的高表达密切相关，而低积累柠檬酸与CsCit高表达促进更多柠檬酸从液泡输出进入细胞质密切相关。而光照影响果实苹果酸和柠檬酸含量，主要通过调控CsALMT9-like和CsPH8的表达相关。另外，系统比较柑橘不同样品之间、柑橘样品和梨样品之间、不同光条件样品之间苹果酸积累相关基因的表达，结合转基因分析结果，认为柑橘CsALMT9-like是调控柑橘不同组织是否能够大量积累苹果酸的关键因子。
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