摘要
目的: 胰腺癌(PC)是一种预后极差的消化系统实体肿瘤，其发病率及死亡率居高不下，严重威胁人类的生命健康和生活质量，当前其致病机制仍未被完全阐述清楚。泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，其在肿瘤的发生和进展中起着至关重要的作用，与含有泛素的去泛素化酶家族互相作用的基序(motifinteractingwithUb-containingnovelDUBfamily,MINDYs)家族成员MINDY2作为一种新发现的去泛素化酶(Deubiquitinatingenzymes,DUBs)，其在胰腺癌中的作用尚不清楚。课题组通过生物信息学分析研究MINDY2在胰腺癌中的潜在价值，并进一步探讨MINDY2对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，研究MINDY2在胰腺癌中发挥促癌作用的分子机制，为胰腺癌的诊断和治疗提供新的思路。 方法: 通过GEO、UALCAN、TCGA和GTEx等数据库进行生物信息学分析了解MINDY2在胰腺癌中表达以及与预后的相关性，从TCGA数据库获取胰腺癌的RNAseq数据及相应临床信息，分析MINDY2与胰腺癌患者的T分期、N分期、病理分级及肿瘤分期的相关性，ROC曲线分析MINDY2在胰腺癌中的诊断价值，TIDE算法预测MINDY2在胰腺癌中潜在的免疫治疗反应，通过TCGA数据库分析MINDY2在胰腺癌中与EMT(epithelial-mesenchymaltransition)、炎症反应、ECM相关基因、血管生成、肿瘤炎症特征以及TGFB的相关性，并进行免疫相关性分析了解MINDY2与免疫细胞浸润评分和免疫检查点相关基因表达的相关性。 通过qRT-PCR和Westernblot实验检测MINDY2在人胰腺癌组织及邻近正常组织和胰腺癌细胞系(6株)及正常胰腺导管上皮细胞中的表达。在包含90例胰腺癌及对应邻近正常胰腺组织样本的组织微阵列(TMA)中进行免疫组化分析了解MINDY2表达情况，并分析MINDY2的表达与组织芯片中包含的胰腺癌患者对应的临床病理参数之间的关系。通过小干扰RNA对MINDY2进行沉默，qRT-PCR和Westernblot实验验证沉默效率，构建过表达、下调以及对应阴性对照组稳转慢病毒株，验证感染效率后通过CCK-8实验、克隆平板实验、EdU实验、流式细胞术、Transwell实验、伤口愈合实验、裸鼠皮下成瘤实验和裸鼠脾包膜肝转移实验等检测MINDY2在体内和体外对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，对裸鼠皮下成瘤瘤体组织免疫组织化学染色观察Ki-67和PCNA表达水平，对肝转移模型解剖肝脏进行HE染色观察肿瘤转移情况。Westernblot实验检测MINDY2对EMT相关蛋白及细胞周期相关蛋白的影响。 Co-IP实验、蛋白质谱分析和生物信息学分析筛选ACTN4作为MINDY2的靶蛋白，并通过qRT-PCR、Westernblot及泛素化实验验证MINDY2对ACTN4的调控作用，下调ACTN4后通过CCK-8实验、克隆平板实验、EdU实验、流式细胞术、Transwell实验、伤口愈合实验等进行回复实验，生物信息学分析筛选PI3K/AKT/mTOR作为下游靶通路，并在胰腺癌细胞中上调MINDY2、下调ACTN4及加入PI3K抑制剂(LY294002)后通过Westernblot验证MINDY2及ACTN4对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。 结果: 基于GEO、TCGA等数据库进行生物信息学分析结果提示MINDY2在胰腺癌中表达高于邻近正常组织，并且与预后不良有关，ROC曲线提示MINDY2在胰腺癌中具有较高的诊断价值，TIDE算法预测得出MINDY2表达越高，胰腺癌对于免疫检查点抑制剂的响应越差。结合TCGA数据库中胰腺癌的RNAseq数据及相应临床信息分析发现MINDY2在胰腺癌中与EMT、炎症反应、ECM相关基因、血管生成、TGFB及肿瘤炎症特征等促癌因素呈正相关关系，免疫相关性分析提示MINDY2深度参与胰腺癌中免疫细胞浸润，并与免疫检查点相关基因表达有关。qRT-PCR、Westernblot以及组织芯片结果提示无论在胰腺癌组织还是胰腺癌细胞系中，MINDY2表达均高于邻近正常组织或正常胰腺导管上皮细胞，对患者临床病理资料进行分析发现MINDY2的表达与患者预后不良相关。构建过表达及低表达MINDY2慢病毒稳转株后，通过CCK-8实验、克隆平板实验、EdU实验、流式细胞术、Transwell实验和伤口愈合实验等证实MINDY2在体内促进胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，Westernblot实验发现MINDY2与细胞周期相关蛋白表达具有相关性，并且可以促进EMT的发生。裸鼠皮下成瘤实验和裸鼠脾包膜肝转移实验结果提示MINDY2可以促进胰腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力和转移能力，免疫组织化学结果提示MINDY2与Ki-67和PCNA表达呈正相关，对肝转移模型解剖肝脏进行HE染色发现MINDY2上调后肝转移瘤大小及数量明显强于对照组。Co-IP、蛋白质谱分析结合生物信息学分析确定ACTN4作为MINDY2的目标靶蛋白，qRT-PCR及Westernblot结果发现MINDY2只在蛋白水平影响ACTN4,泛素化实验提示MINDY2通过去泛素化修饰ACTN4进而稳定ACTN4的蛋白水平。通过CCK-8实验、克隆平板实验、EdU实验、流式细胞术、Transwell实验、伤口愈合实验等进行回复实验发现，下调ACTN4后MINDY2促进胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力被降低。KEGG数据库分析发现ACTN4可能是PI3K/AKT/mTOR信号通路的上游基因，进一步生物信息学分析发现MINDY2和ACTN4均与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关，Westernblot实验发现过表达MINDY2后PI3K/AKT/mTOR通路的磷酸化水平明显升高，加入PI3K抑制剂(LY294002)后该MINDY2对该信号通路的影响被减弱，下调ACTN4后取得了相似的效果。 结论: MINDY2通过去泛素化功能稳定ACTN4蛋白表达进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胰腺癌增殖、侵袭及迁移。
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