摘要
目的: 随人口老龄化的日益增长，痴呆症和脑血管疾病的发病率和致残率逐年上升。痴呆症可引起多个获得性认知领域的认知丧失，其严重程度足以影响个人的社会生活和家庭的生活压力。血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是因出血性损伤、缺血性梗塞或遗传因素，致使脑组织长期处于慢性低灌注状态，进而产生神经认知功能障碍的一种疾病。虽然血管性痴呆不具有传染性，但以脑血管病变和认知功能障碍为特征，给家庭和社会带来了沉重的负担。血管性痴呆中，氧化应激机制是其分子机制中重要组成部分，因活性氧的产生和清除依赖于线粒体功能正常，且当机体发生氧化应激损伤时，线粒体首当其冲受到影响。线粒体自噬作为调控线粒体质量的一道关卡，在血管性痴呆中的作用机制中起重要作用。血管性痴呆目前尚无特效药，因中医药的多靶点、多层次、多通路等作用特点，在防治血管性痴呆方面发挥着越来越重要的作用。基于我们团队前期关于补肾益智方(Bushen-Yizhi formula,BSYZ)对阿尔兹海默病的神经保护和改善学习记忆的大量体内外实验结果，并根据中医理论中异病同治原则，及血管性痴呆临床治疗以补肾填髓得到良好疗效，故认为补肾益智方对于血管性痴呆中线粒体自噬相关机制的研究值得进一步探讨。 在本实验中，采用的是大鼠双侧颈总动脉结扎(Bilateral Common Carotid Artery occlusion,BCCAo)所致的慢性脑灌注不足模型和PC12细胞氧糖剥夺/复氧(Oxygen and Glucose Deprivation /Reoxygenation,OGD )模型，从线粒体自噬角度，探究补肾益智方对血管性痴呆的作用及可能的机制。此外，在PC12细胞体外模型中，另加入溶酶体抑制剂氯喹进一步验证线粒体自噬对血管性痴呆的影响。 方法: 1.对40只雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠进行BCCAo手术造模。动物分组如下:Sham 组(假手术对照组)、BCCAo 组(BCCAo 模型组)、BSYZ 3g/(kg·d)组(BCCAo+ 3g/(kg·d)BSYZ 组)、BSYZ 6g/(kg·d)组(BCCAo + 6g/(kg d) BSYZ 组)。BCCAo手术7天后，各组每天给予等体积的相应药物或生理盐水，给药共28天，随后行旷场实验和Morris水迷宫实验，以评估大鼠学习记忆功能的改善情况。 2.SD大鼠行为学实验结束后，取大鼠脑组织冰冻切片行尼氏染色、Tunel原位细胞凋亡试剂盒检测对补肾益智方对凋亡的影响，硫磺素T染色检测补肾益智方对淀粉样蛋白沉积的影响，免疫荧光染色检测补肾益智方对线粒体自噬的影响;取大鼠脑组织蛋白行氧化应激相关试剂盒检测补肾益智方对氧化应激损伤的影响，Western blot、线粒体分离试剂盒检测补肾益智方对线粒体自噬相关蛋白的影响。 3.为检测补肾益智方含药血清对细胞的毒性，行MTT法检测各浓度补肾益智方含药血清中PC12细胞的存活率。实验分组如下:Control组(空白实验组+10％正常血清)、CQ组(CQ+10％正常血清;氯喹，Chloroquine,CQ,50μM,一种自噬抑制剂,抑制溶酶体和自噬体的结合)、OGD组(氧糖剥夺组)，OGD + CQ组(OGD + CQ+ 10％正常血清)，OGD + 2.5％ BSYZ (OGD + 2.5％ BSYZ 含药血清 +7.5％正常血清)，OGD + 5％BSYZ (OGD+ 5％ BSYZ 含药血清 +5％ 正常血清)，OGD+10％BSYZ (OGD + 10％ BSYZ 含药血清)，OGD + CQ+ 10％ BSYZ 组(OGD + CQ+ 10％BSYZ含药血清)。PC12细胞种板24小时后，加入CQ继续孵育2小时，随后对PC12细胞予以2小时氧糖剥夺和22小时恢复氧糖环境的OGD实验促使细胞损伤，在恢复氧糖环境同时各组给予补肾益智方含药血清或正常血清治疗。PC12细胞经OGD及药物治疗后,行MTT实验检测补肾益智方含药血清对OGD细胞损伤模型存活率的影响,行细胞形态学观察实验检测补肾益智方含药血清对OGD细胞损伤模型细胞形态的影响，行氧化应激相关试剂盒、细胞活性氧检测试剂盒检测补肾益智方含药血清对OGD细胞损伤模型氧化应激损伤的影响，行线粒体膜电位试剂盒、线粒体荧光染色和Hoechst 33342活细胞染色免疫应该双标检测补肾益智方含药血清对OGD细胞损伤模型线粒体的影响，提取各组细胞蛋白行Western blot检测补肾益智方对线粒体自噬相关蛋白的影响。 结果: (1)补肾益智方可改善BCCAo所致慢性脑灌注不足大鼠模型情绪、学习记忆功能:在旷场实验中，与模型组比补肾益智方组可明显增加大鼠在中心区域停留的时间(P=0.002＜0.005)和中心区域运动的总路程(P=0.016＜0.05);在Morris水迷宫实验第七天撤去平台后，大鼠在目标象限停留的时间明显延长(P=0.011＜0.05)。 (2)补肾益智方可改善BCCAo所致慢性脑灌注不足大鼠模型凋亡损伤和淀粉样蛋白异常沉积:在尼氏染色实验中，与模型组比，补肾益智方组的尼氏小体在海马C1和C2区数量、密度均有明显增加;在硫磺素T染色实验中，与模型组比，补肾益智方组淀粉样蛋白沉积所代表的绿色荧光在海马C1和C3区荧光强度和数量明显降低、减少。 (3)补肾益智方可改善BCCAo所致慢性脑灌注不足大鼠模型氧化应激损伤:在氧化应激相关试剂盒实验中，与模型组比，补肾益智方可明显增加谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)和抗氧化剂超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的水平(P=0.024＜0.05;P=0.023＜0.05;P=0.000＜0.001)，并降低脂质过氧化物的丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平(P=0.008＜0.05)。 (4)补肾益智方可改善慢性脑灌注不足大鼠模型中线粒体自噬功能障碍，促进线粒体自噬中PINK1/ Parkin通路对受损线粒体的清除而起到抗凋亡作用:Western blot实验中，与模型组比，补肾益智方给药后促凋亡Bax蛋白含量明显减少( P=0.030＜0.05)，抗凋亡Bcl-2蛋白含量明显增多(P=0.019＜0.05);Tunel法染色实验中，与模型组比，补肾益智方组海马C3区荧光数目和强度有明显减少和减弱;动物总蛋白行Western blot实验发现，与模型组比，补肾益智方组抗氧化剂SOD2蛋白含量明显增加、自噬通量LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白含量明显减少，而溶酶体相关蛋白Lamp1蛋白含量明显增多(P=0.000＜0.001;P=0.000＜0.001;P=0.001 ＜0.005);随后使用线粒体分离试剂盒将动物线粒体蛋白和浆蛋白分离，分别行Western blot检测，发现模型组PINK1和Parkin蛋白从细胞浆转移到线粒体上蓄积，且LC3Ⅱ/ Ⅰ在线粒体中明显增多，给予补肾益智方后PINK1、Parkin和LC3Ⅱ/Ⅰ在线粒体内的蓄积明显减少(P=0.047＜0.05;P=0.000＜0.001;P=0.030＜0.05 )，在浆蛋白的水平得以恢复(P=0.000＜0.001;P=0.029＜0.05);在LC3和ATPB荧光双染实验中，与正常组比，LC3荧光强度和数量明显减弱、减少;上述结果表明给予补肾益智方后促进线粒体自噬清除受损的线粒体。 (5)补肾益智方含药血清可改善OGD所致PC12细胞损伤模型中氧化应激损伤:在对PC12细胞存活率和形态学检查发现，与OGD组相比，给予补肾益智方含药血清后，PC12细胞的存活率和形态均有明显改善(P=0.001＜0.005);随后在相关的氧化应激损伤试剂盒检测中，发现与OGD组相比，补肾益智方含药血清可明显增加抗氧化剂GSH、GR、SOD和一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的水平(P=0.000＜0.001;P=0.022＜0.05;P=0.006＜0.05;P=0.000＜0.001 )，并降低有害的MDA水平(P=0.002＜0.005);在活性氧检测试剂盒检测中，发现与OGD组相比，补肾益智方含药血清可明显减少活性氧绿色荧光的数量和强度。 (6)补肾益智方含药血管性痴呆血清可改善OGD所致PC12细胞损伤模型中线粒体形态和线粒体膜电位的下降:在使用线粒体膜电位检测试剂盒检测中，发现与OGD组比，补肾益智方含药血清可明显恢复线粒体膜电位;在线粒体红色荧光和Hoechst细胞核双染实验中，发现与OGD组比，给予补肾益智方含药血清可明显改善线粒体线性形态和数量，然在自噬抑制剂CQ存在下，补肾益智方含药血清并不能完全改善线粒体形态和数量。 结论: 实验结果显示补肾益智方对血管性痴呆体内外模型均具神经保护作用，其具体机制可能是通过改善线粒体自噬功能障碍，促进线粒体自噬中Lamp1通路清除受损的线粒体，减缓氧化应激状态，补肾益智方可作为预防和改善血管性痴呆临床症状的潜在候选的中医复方，值得进一步研究验证。
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