摘要
目的/意义: 糖尿病周围神经病理性疼痛(Diabeticperipheralneuropathicpain,DPNP)由糖尿病或糖尿病前期导致的周围神经病理性疼痛异常，是糖尿病(Diabetesmellitus,DM)最常见的并发症之一。该疾病起病缓慢隐蔽，从痛觉过敏逐步发展为顽固性、不可逆性的神经损伤，导致患者对疼痛和温度感觉障碍，甚至消失，严重影响患者的生存及生活质量。然而目前针对这种慢性神经病变尚无有效的治疗手段。因此，研究DPNP的发病机制对有效治疗措施的获取、患者生存质量的改善和医疗成本的降低，具有重要的意义。 小檗碱(Berberine,BBR)是一种以季异喹啉为基础结构的天然生物碱，存在于多种清热解毒类中药。近年来，小檗碱作为一种多靶点治疗的药物，对糖尿病、动脉粥样硬化和心血管疾病等均具有良好效果。其中，含小檗碱成分较高的一些中药如黄连、黄柏等已被单独或作为中药复方中的重要药材，用于临床治疗糖尿病周围神经病变，在改善神经病理性疼痛异常方面取得了一定的疗效，但机制不详。 因此，本研究拟通过制备链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的DPNP大鼠模型和高糖诱导的背根神经节(Dorsalrootganglia,DRG)细胞模型，多途径探讨小檗碱对DPNP大鼠的缓解作用及对疼痛相关信号通道TRPA1(TransientreceptorpotentialA1)蛋白在DPNP发展后期的表达量变化，并在此基础上进一步探讨验证其上游靶点AMPK(AMP-activatedproteinkinase)调控TRPA1蛋白表达的相关机制研究。为小檗碱更好地应用于临床提供理论基础，有效地防治神经病理性疼痛异常提供新的策略，具有较好的理论意义和实用价值。 方法: 培养原代背根神经节细胞进行细胞实验，通过注射链脲佐菌素构建DPDP大鼠模型，通过行为药理学方法观测大鼠DPNP疾病发展，运用生物医学实验技术检测原代DRG细胞和组织，探究小檗碱对DPNP疾病的治疗作用及其机制研究。 1.细胞实验:提取原代DRG细胞进行细胞培养，高糖诱导细胞进行疾病造模;根据实验设计进行CompoundC干预，验证加入CompoundC诱导后，抑制AMPK对TRPA1蛋白表达的影响;最后，加入小檗碱干预24h，收板后进行生物医学实验检测:1)免疫荧光技术鉴定DRG细胞;2)CCK-8法检测小檗碱进行细胞给药的最佳浓度;3)Westernblot检测DRG细胞中TRPA1蛋白和AMPK蛋白及其磷酸化水平;4)RT-qPCR检测细胞中TRPA1的mRNA表达水平;5)免疫荧光实验观察DRG细胞TRPA1的表达。 2.动物实验:将SD雄性大鼠随机分组，通过STZ诱导DM大鼠模型，在高糖情况下持续10周及以上，待机械痛阈值和热痛潜伏期处于一个高且稳定的值，即DPNP模型建立成功;根据实验设计进行CompoundC干预，验证注射CompoundC干预后，抑制体内AMPK对TRPA1蛋白表达的影响;最后，再进行持续2周小檗碱给药后取材。实验期间每周进行行为学实验，检测指标分别为机械痛阈值、热痛潜伏期、随机血糖和体重。取材后进行生物医学实验检测:1)Westernblot检测DRG组织中TRPA1蛋白和AMPK蛋白及其磷酸化水平;2)RT-qPCR检测DRG组织中TRPA1的mRNA表达水平;3)免疫组化检测大鼠爪垫表皮内神经纤维数量。 结果: 1.细胞实验:造模后，高糖诱导的模型组细胞，p-AMPKThr172表达被下调，TRPA1蛋白表达被上调;在小檗碱给药后，小檗碱上调p-AMPKThr172的表达，下调TRPA1蛋白表达和mRNA表达水平;CompoundC干预后，AMPK磷酸化表达被抑制，小檗碱给药对DRG细胞中TRPA1蛋白表达和mRNA表达水平没有起到下调作用; 2.动物实验:STZ诱导后，模型组较对照组的机械痛阈值和热痛潜伏期明显升高;小檗碱给药后，小檗碱给药组的大鼠较DPNP模型组大鼠，机械痛阈值和热痛潜伏期明显降低;CompoundC干预后，小檗碱给药对机械痛阈值和热痛潜伏期没有起到降低的作用;血糖和体重在小檗碱给药前后没有显著差异。取材进行检测后得到:模型组大鼠较对照组大鼠DRG组织的p-AMPKThr172表达量低，TRPA1蛋白表达高，爪垫表皮神经纤维缺失;给药后，小檗碱可促进大鼠DRG组织中AMPK的磷酸化，上调p-AMPKThr172的表达，下调TRPA1蛋白表达和mRNA表达水平，逆转爪垫表皮神经纤维缺失，其中，TRPV1的蛋白和核酸表达水平不存在差异;CompoundC干预后，DRG组织中AMPK磷酸化被抑制，小檗碱给药对TRPA1蛋白表达和mRNA表达水平不能起到下调作用，大鼠后爪爪垫表皮神经纤维的缺失不被逆转。 结论: 小檗碱可有效缓解糖尿病周围神经病理性疼痛异常的症状，使大鼠的机械痛阈值和热痛潜伏期回归至健康值附近，促进AMPK的磷酸化，抑制TRPA1的表达，改善爪垫表皮神经纤维的缺失。其潜在机制可能是，在体内外环境中，小檗碱均通过AMPK磷酸化负调控TRPA1的蛋白表达以改善DPNP疾病。
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