摘要
目的: 获得性放射抵抗被认为是促使鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)放射治疗失败后复发转移的主要原因之一，可能与X射线诱导的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)激活有关。生物钟基因BMAL1被证明与NPC的放疗敏感性存在相关性，但具体机制未见研究报道。本研究旨在通过体内外实验，探讨生物钟基因BMAL1对NPC获得性放射抵抗和EMT的影响及分子机制，为提高临床放射治疗效率提供理论基础及实验室依据。 方法: 1、探究BMAL1基因在NPC细胞系中的表达情况、耐放射细胞株的建立与生物学行为、EMT验证:(1)通过蛋白质免疫印迹法检测NPC细胞系CNE1，HONE1和5-8F对比人鼻咽永生化上皮细胞NP69中BMAL1蛋白的表达情况;(2)通过2Gy分次照射5-8F细胞株构建NPC耐放射细胞株5-8FR(70Gy)，运用克隆形成实验验证耐放射细胞株构建情况;(3)通过蛋白质免疫印迹法、CCK-8增殖实验、划痕实验和Transwell法验证5-8FR中EMT相关指标、增殖、迁移和侵袭能力改变情况。 2、探究BMAL1基因对NPC获得性放射抵抗的影响:(1)通过蛋白免疫印迹法探究放射剂量与BMAL1蛋白表达的相关性;(2)用BMAL1基因过表达(BMAL1-OE)及其空白对照组(OENC)的慢病毒感染NPC耐放射细胞系5-8FR,通过蛋白质免疫印迹法验证转染效率;(3)运用克隆形成实验探究耐放射细胞株5-8FR中BMAL1基因对NPC获得性放射抵抗的影响。 3、探究BMAL1基因对TGF-β1/Smads通路的影响:(1)分别用BMAL1基因的过表达（BMAL1-OE）和敲除（sh-BMAL1）及其空白对照组（OENC/shNC）慢病毒感染NPC细胞系5-8F和HONE1,通过蛋白质免疫印迹法验证转染效率;（2）通过蛋白质免疫印迹法检测NPC细胞中过表达、干扰BMAL1基因时，TGF-β1/Smads通路相关蛋白的表达情况。 4、探究BMAL1基因影响NPC获得性放射抵抗的机制:（1）在体外，通过蛋白质免疫印迹法、CCK-8增殖实验、划痕实验、Transwell法、流式细胞术、EDU法和核浆分离试验探究外源性添加重组人TGF-β1刺激因子时BMAL1基因对5-8FR细胞系中EMT、增殖、迁移、侵袭能力、放疗后凋亡、放疗后DNA合成能力和核易位的影响;（2）在体内，通过裸鼠皮下成瘤模型绘制放疗前后裸鼠移植瘤生长曲线，处死裸鼠后将移植瘤称取瘤重并进行HE染色、免疫组织化学染色和TUNEL染色，探究NPC中BMAL1基因对EMT和放射敏感性的影响机制。 结果: 1、BMAL1基因在NPC细胞系中的表达情况、耐放射细胞株的建立与生物学行为、EMT验证结果提示:（1）与正常鼻咽上皮细胞相比，NPC细胞系中的BMAL1蛋白表达明显下调（p＜0.05）;（2）克隆形成实验提示耐放射细胞株5-8FR对比5-8F细胞株，在不同放射剂量下集落形成率更高（p＜0.05），通过拟合剂量-存活曲线并计算耐放射细胞株5-8FR的放射增敏比为1.256（＞1）,提示耐放射细胞株5-8FR构建成功;(3)耐放射细胞株5-8FR中存在EMT激活，且伴有增殖、迁移和侵袭能力显著增强（p＜0.05）。 2、BMAL1基因对NPC获得性放射抵抗的影响研究结果提示:（1）在常规剂量诱导NPC细胞发生放射抵抗的过程中，存在BMAL1基因蛋白表达产物的逐步下调，且两者呈反比例关系;（2）BMAL1基因的过表达（BMAL1-OE）慢病毒有效上调耐放射细胞株5-8FR中BMAL1蛋白的表达（p＜0.05），并成功筛选出稳转细胞株;（3）克隆形成实验提示5-8FRBMAL1-OE组细胞对比其对照组，在不同放射剂量下集落形成率更低（p＜0.05）,通过拟合剂量-存活曲线并计算5-8FRBMAL1-OE组细胞放射增敏比为0.801（＜1），提示BMAL1基因能显著提升耐放射细胞株5-8FR的放射敏感性，逆转NPC的获得性放射抵抗。 3、BMAL1基因对TGF-β1/Smads通路的影响研究结果提示:（1）BMAL1基因的过表达（BMAL1-OE）及干扰慢病毒（sh-BMAL1）感染后能有效上调5-8F和下调HONE1细胞株中BMAL1蛋白的表达(p＜0.05)，并分别成功筛选出稳转细胞株;(2)BMAL1基因过表达对比其对照组能显著抑制NPC细胞中TGF-β1/Smads通路相关蛋白的表达，干扰BMAL1基因则结果相反(p＜0.05)。 4、BMAL1基因与NPC获得性放射抵抗的机制研究结果提示:(1)在外源性重组人TGF-β1刺激因子的诱导下，TGF-β1/Smads信号通路活性增强，耐放射细胞株5-8FR中EMT进一步激活，并伴有增殖、迁移和侵袭能力进一步提升(p＜0.05);同时，放疗后抗凋亡、DNA合成能力提升，促进p-Smad2向核内移位，核内转录因子Snail1表达上调(p＜0.05);而过表达BMAL1基因可逆转TGF-β1的以上诱导作用，表现为失活EMT，显著抑制增殖、迁移和侵袭能力，明显增加耐放射细胞株5-8FR放疗后凋亡，放疗后DNA合成能力受到抑制，p-Smad2核易位减少，核内转录因子Snail1表达明显下降(p＜0.05);(2)体内试验表明，外源性添加TGF-β1刺激因子能促进移植瘤生长，促进EMT,增加放射抵抗性(p＜0.05);过表达BMAL1基因能逆转以上由TGF-β1诱导产生的作用，表现为明显抑制裸鼠移植瘤的生长，失活EMT，促进放疗后凋亡，从而提升NPC的放射敏感性(p＜0.05)。 结论: 1、生物钟基因BMAL1抑制鼻咽癌中TGF-β1/Smads信号通路蛋白的表达。 2、生物钟基因BMAL1通过失活TGF-β1/Smads通路抑制辐射诱导的EMT，抑制鼻咽癌耐放射细胞株的增殖、迁移和侵袭能力。 3、生物钟基因BMAL1与鼻咽癌获得性放射抵抗有关，通过失活TGF-β1/Smads/Snail1轴抑制辐射诱导的EMT，诱导鼻咽癌放射增敏。
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