摘要
[目的] 柴胡是传统的大宗药材，需求量大，但市场有许多柴胡混淆品，严重威胁了柴胡临床应用和制剂生产安全。本研究旨在对正品柴胡及市场常见混淆品进行系统的生药学研究，建立快速、准确的鉴别新方法，为柴胡的鉴别及质量控制提供科学依据。 [方法] 本研究针对柴胡及市场上常见的混淆品进行系统的生药学研究，包括基原、性状-微性状、显微、高效薄层色谱(HPTLC)及分子鉴别等5个方面。基原鉴别通过对原植物进行解剖观察，并与《中国植物志》进行对比，并制作腊叶标本。性状-微性状鉴别法通过对90余批柴胡及混淆品的大小、形态、横切面等特征进行观察研究。显微鉴别研究采用普通光明场与偏振光暗场对比观察法，结合实时景深扩展成像及大图影像拼接技术，对组织构造和粉末特征进行观察研究。高效薄层色谱法基于《中国药典》方法，通过优化展开剂、显色剂等条件，建立了专属性更高的鉴别新方法，并进行方法学考察。分子鉴别基于《中国药典》DNA条形码技术，对柴胡及常见混淆品的ITS、psbA-trnH序列分别进行对比分析，识别差异位点并设计特异性引物，并结合植物组织直接PCR技术进行PCR扩增鉴别。 [结果] 1.基原鉴别，本研究获得了柴胡及5种混淆品的原植物特征高清影像数据及腊叶标本，总结了基原鉴别主要特征并制作了鉴别检索表。发现综合根、茎、叶和小总苞片特征可鉴别柴胡及常见混淆品，如北柴胡茎呈“之”字形弯曲，叶披针形;南柴胡茎基密覆叶柄残余纤维，叶线形;竹叶柴胡多单茎，基部带紫色;藏柴胡根表面具横长凸起的皮孔;大叶柴胡叶大型，基部心形抱茎;三岛柴胡根皮黄褐色，木化，质硬;黑柴胡小总苞片6～9,大小不一，长过小伞形花序0.5～1倍。 2.性状鉴别，获取了柴胡及6种混淆品的精细微性状影像数据，总结了性状鉴别主要特征并制作了鉴别检索表。发现药材中上部横切面特征分化更明显，如北柴胡木质部呈5～8轮同心环状，锥叶柴胡木质部呈“羽毛状花瓣”样，藏柴胡韧皮部具黄棕色或黑棕色环纹，竹叶柴胡和三岛柴胡木质部呈致密放射状;大叶柴胡入药部位多为根茎，表面密生环节;黑柴胡根皮易脱落，横切面木质部呈1～3轮同心环。 3.显微鉴别，获取了柴胡及6种混淆品横切面及粉末显微普通光及偏振光全息彩色影像数据，总结了显微鉴别主要特征并制作了鉴别检索表。横切面显微主要鉴别特征为木纤维、导管、油管及油室的数量及分布规律，如北柴胡木纤维发达，与木薄壁细胞成3～8轮同心环状，南柴胡导管数量众多，与木薄壁细胞排列成单环状，锥叶柴胡导管多外侧多歧状分支，呈“羽毛状花瓣”样，大叶柴胡根茎横切面皮层有大型油室断续环列;粉末显微主要鉴别特征为木纤维、油管及油室，如北柴胡木纤维初生壁破碎成短须状，南柴胡木纤维表面具稀疏螺状或双螺状裂缝，锥叶柴胡木纤维末端多平截，大叶柴胡可见大型油室碎片。 4.高效薄层色谱鉴别，新建方法展开剂体系为乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1),显色剂为1％NP甲醇溶液和10％茴香醛溶液，方法学考察显示本方法具有良好的专属性和耐用性。1％NP甲醇溶液显色后，竹叶柴胡出现专属的橙黄色斑点，与北柴胡有显著区别，结合10％茴香醛显色后的色谱轮廓，可完全区分柴胡及常见混淆品。 5.分子鉴别，设计筛选了5对特异性引物，并对PCR扩增条件进行优化，可成功鉴别5种柴胡混淆品，特异性引物IF/R-5在30个循环时可鉴别大叶柴胡、35个循环可鉴别黑柴胡，特异性引物PF/R4-2、18Sa/26Sb可分别鉴定藏柴胡和锥叶柴胡，特异性引物IF/R-2与PXF/R-7混合PCR可鉴别三岛柴胡。 [结论] 本研究基于柴胡及其常见混淆品的生药学研究，建立了基原、性状-微性状、显微、高效薄层色谱及分子鉴别新方法。这些方法在快速、准确鉴别柴胡及混淆品方面表现良好，可实现柴胡及常见混淆品的快速、准确鉴别，为柴胡的鉴别及质量控制提供了科学依据。
NETL