摘要
目的: 探讨组蛋白去乙酰化酶1(Histonedeacetylase1,HDAC1)介导的蛋白乙酰化修饰在进展期腺瘤(AdvancedAdenoma,AA)一结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)演进过程中的作用机制。探明四君子汤在CRC癌前状态下的功效及潜在作用机制。 方法: (1)通过蛋白免疫印记、免疫荧光的方法检测腺瘤组织和CRC组织中蛋白乙酰化的水平变化，进一步将收集到的组织样本采用串联质谱标签(TandemMassTags,TMT)定量蛋白乙酰化及蛋白质组学技术检测，并进行数据采集，运用聚类分析、富集分析等手段进行进一步的生物信息学分析。 (2)通过癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)数据库检索，以及结合PCR检测验证HDAC1在CRC中的表达。基于组织芯片，Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析评估HDAC1的表达水平对CRC患者预后的影响。进一步通过免疫荧光实验检测腺瘤向CRC转化中HDAC1的表达。在体外实验中，利用短发夹RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)和过表达质粒转染HCT116和LoVo细胞系，构建HDAC1敲低和过表达的稳转细胞株，并利用CCK8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。在体内实验部分，C57BL/6小鼠用AOM(Azoxymethane,AOM)联合DSS(Dextransulphatesodium,DSS)造模，构建炎症相关结直肠癌小鼠模型，HDAC抑制剂西达本胺进行干预后观察肿瘤生长情况。苏木素-伊红(Haematoxylinandeosin,HE)染色观察组织病理情况，Ki67免疫组织化学染色检测肿瘤细胞增殖水平;AB(Alcianblue,AB)染色和WGA(WheatGermAgglutinin,WGA)-FITC染色观察肠道屏障功能;对于炎症因子的检测主要采用酶联免疫吸附法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)进行，进一步对HDAC1的功能开展研究。 (3)通过蛋白质免疫印迹法(WesternBlot，WB)在沉默或过表达HDAC1的结直肠癌细胞株中检测下游靶点HADH的表达变化，并采用免疫共沉淀的方法研究HDAC1与HADH的相互作用。通过免疫荧光的方法检测HADH在西达本胺干预的结直肠腺癌小鼠中的表达。之后，在HDAC1沉默细胞中过表达HADH观察其对肠癌细胞的生物学功能的影响。最后，HDAC1过表达的HCT116细胞进行靶向代谢组学检测，对差异代谢物进行分析。此外，在西达本胺干预的结直肠腺癌小鼠肠道组织中检测了相关代谢物的水平。 (4)利用DSS循环诱导法构建慢性结肠炎小鼠，记录息肉生成的数量、肠道长度等情况;HE染色观察肠道组织病理情况;采用AB染色和WGA染色以及免疫组化的方法检测杯状细胞数量、肠道黏液含量以及黏蛋白的糖基化水平,观察四君子汤对于肠道黏液屏障的影响;免疫组化检测紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的表达，观察四君子汤对于肠道物理屏障的影响;最后采用免疫荧光检测HDAC1及HADH的表达水平。 结果: (1)在AA-CRC的演进过程中，蛋白乙酰化的水平是显著降低的。GO分析以及KEGG通路富集结果提示，在AA-CRC演进中差异乙酰化蛋白的功能主要与支链氨基酸和长链脂肪酸(Longchainfattyacid,LCFA)的代谢相关。 (2)HDAC1在结直肠癌患者中显著高表达，并与预后不良相关。在AA-CRC演进过程中，HDAC1的表达持续升高。沉默HDAC1抑制HCT116和LoVo细胞的增殖、迁移和侵袭能力，过表达则促进肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。HDAC抑制剂西达本胺能够抑制AOM/DSS诱导的小鼠结直肠腺癌的发生，并且改善肠道病理情况、抑制细胞恶性增殖、减轻炎症、保护肠道屏障功能。 (3)差异乙酰化蛋白的富集分析表明线粒体脂肪酸β氧化酶HADH参与AA向早期CRC的进展中支链氨基酸和长链脂肪酸的代谢。HDAC1沉默抑制HADH的表达，而HDAC1过表达促进HADH的表达。进一步的研究表明，HDAC1的过表达可能通过降低HADH的乙酰化水平，进而影响了HADH的表达。在AOM/DSS模型小鼠中，HADH在肠道中的表达显著增加，而西达本胺干预可以显著降低HADH的表达。在HCT116和LoVo细胞系中，沉默HDAC1后过表达HADH,能够恢复HDAC1沉默对于结直肠癌细胞生物学功能的影响。在HCT116中过表达HDAC1促进LCFA代谢。在AOM/DSS模型小鼠中也检测到相关LCFA的含量降低，而西达本胺干预后能够升高其中亚油酸的含量水平。 (4)四君子汤能够改善DSS诱导的肠道损伤，抑制肠道息肉生成，减轻肠道组织炎症状态，增加杯状细胞数量及肠道黏液含量，升高MUC2的表达，改善黏蛋白糖基化水平，恢复紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的表达，保护肠道物理和黏膜屏障功能。四君子汤干预后HDAC1和HADH的表达较模型组明显降低。 结论: (1)蛋白乙酰化水平在AA-CRC演进过程中不断降低 (2)去乙酰化酶HDAC1促进AA-CRC的恶性转化 (3)HDAC1通过HADH介导的LCFA氧化发挥调控作用 (4)四君子汤改善慢性结肠炎，其作用机制可能与HDAC1介导的HADH表达相关。
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