摘要
目的 本研究拟从肠道微生物及代谢物的角度，揭示乳癌三阴方预防三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,TNBC)术后复发转移的分子机制，并基于真实世界研究，探索其最佳服用时长，为今后中西医结合治疗TNBC提供依据。 方法 1.基于多中心回顾性队列研究方法，评估2016.11～2019.10接受乳腺癌术后西医标准治疗，包括手术、化疗和/或放疗的早期TNBC患者。以乳癌三阴方为暴露因素，暴露组在西医标准治疗后接受乳癌三阴方治疗，非暴露组接受单纯观察。3年无病生存率(disease-freesurvival,DFS)为主要疗效指标，3年总生存率(overallsurvival,OS)为次要疗效指标。并且以暴露组实际服用时间分为3个亚组，通过倾向性评分的方法，将非暴露组与暴露组按照1∶1比例匹配，评估其3年DFS差异。 2.以生存分析结果为依据，收集暴露组分层后的不同亚组患者，非暴露组患者，新确诊TNBC患者，以及健康志愿者粪便样本，通过16SrRNA测序以及LC-MS技术筛选肠道差异菌属及衍生代谢物。并建立肠道菌群移植(fecalmicrobiotatransplantation,FMT)荷瘤小鼠模型以验证差异菌属与肿瘤生长关系。通过CCK8、克隆实验、Transwell以及划痕实验，评估差异代谢物对TNBC细胞系恶性生物学行为的影响。并将差异代谢物喂食4T1荷瘤小鼠，评估其对肿瘤生长的影响。qPCR、流式细胞术和IHC观察小鼠体内免疫细胞浸润及代谢酶的变化。并通过TCGA数据库，构建异位表达的TNBC细胞系，及与免疫细胞共培养，以验证差异代谢物与肿瘤微环境中免疫细胞分化的关系。最后通过体内干预小鼠模型，验证乳癌三阴方干预肠道菌及衍生代谢物，调节免疫微环境的生物机制。 结果 1.研究共纳入635例早期TNBC患者，其中服用乳癌三阴方共315例，接受观察的患者320例。中位随访时间49.9(6～74)个月。暴露组较非暴露组3年DFS绝对获益5.8％[93.3％vs.87.5％,HR=0.58，95％CI,(0.35～0.95),P=0.03],两组在3年OS上未见明显统计学差异[95.9％vs.93.7％,HR=0.65,95％CI(0.32～1.30),P=0.22]。将暴露组依据实际服用时间分层后，相较非暴露组，乳癌三阴方在服用2年及以上可见生存获益趋势（P＜0.05）。经倾向性评分法，将暴露组与非暴露组匹配后，乳癌三阴方实际服用3年及以上，DFS绝对获益11.3％[96.5％vs.85.2％,HR=0.13,95％CI（0.03～0.55）,P=0.001]。 2.TNBC患者肠道菌群失调，表现在微生物α和β多样性下降，进一步筛选出Lachnoclostridium菌是疾病相关的特异性属（LDAvalue＞3.0,P＜0.05），并诱导肠道犬尿氨酸途径激活（kynureninepathway，KP），导致肠道犬尿氨酸（kynurenine,Kyn）含量增加（P＜0.05）。相较于新确诊为TNBC患者肠道微生物结构，服用乳癌三阴方3年以上的患者，肠道Lachnoclostridium菌含量显著降低（P＜0.05），且肠道Kyn含量及Kyn/Trp比值下降（P＜0.05）。进一步通过FMT小鼠模型验证了以Lachnoclostridium为优势的肠道菌在肠道中含量增加可促进小鼠肿瘤的生长（P＜0.05）。这个过程与Kyn在肠道内含量增加有关。 3.接着，通过Kyn体内外干预后，验证了Kyn可促进TNBC细胞系的恶性生物学行为（P＜0.05），以及体内肿瘤的增长（P＜0.05）。当Kyn在肠道内含量增加，可促进吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine2,3-dioxygenase1，IDO1）在肿瘤组织中高表达（P＜0.01）,同时增加肿瘤组织中Tregs细胞浸润，降低CD8+T细胞比例（P＜0.05）。芳香烃受体（ArylHydrocarbonReceptor,AhR）作为Kyn配体，在Kyn体外干预TNBC细胞系后，AhR核内蛋白和总蛋白表达增加（P＜0.05）。并且TGF-β1的转录可被AhR激活（P＜0.05），进一步释放更多的TGF-β炎症因子（P＜0.05），促进Na?veCD4+T细胞向Tregs分化。通过乳癌三阴方体内干预AhR过表达4T1小鼠模型，验证了乳癌三阴方通过降低肠道中Lachnoclostridium菌及衍生的Kyn代谢物（P＜0.05）。抑制肿瘤KP激活（P＜0.01），及Kyn/AhR/TGF-β1通路传导，从而降低Tregs细胞在肿瘤组织中浸润，增加CD8+T细胞浸润比例（P＜0.05）,抑制肿瘤的生长（P＜0.05）。 结论 基于回顾性队列研究证明乳癌三阴方服用3年以上可使TNBC患者3年DFS绝对获益11.3％。这种获益是源于对肠道改善肠道微生态的调整，尤其是显著降低小鼠肠道中Lachnoclostridium菌丰度，有效抑制了肠道微生物参与的犬尿氨酸代谢，以及AhR配体的激活，从而降低下游TGF-β1表达，以及TME中TGF-β炎症因子诱导的Tregs分化，并增加免疫毒性细胞的占比，增强对肿瘤的杀伤作用。
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