摘要
背景:患阿尔茨海默病（Alzheimer''sdisease,AD）的风险会随着年龄的增长而增加。传统中药远志具有安神益智的功能。细叶远志皂苷（Tenuifolin，Ten）作为远志的主要生物活性成分，具有多途径、多靶点的独特优势，目前关于细叶远志皂苷发挥神经保护作用改善认知功能的具体机制尚不明确。 目的:本研究采用D-半乳糖腹腔注射协同Aβ1-42海马定位注射诱导AD小鼠模型，以D-半乳糖协同Aβ1-42诱导HT-22细胞损伤建立AD细胞模型，旨在从突触损伤、线粒体氧化应激、calpain系统、铁死亡多角度研究细叶远志皂苷对AD体内外模型的影响，并通过加入calpain抑制剂calpeptin来确定calpain与神经细胞死亡方式之间的潜在联系。 方法:本研究采用D-半乳糖腹腔注射协同Aβ1-42海马定位注射诱导AD小鼠模型，通过行为学实验和WesternBlot方法评价细叶远志皂苷对AD小鼠学习记忆的影响并采用D-半乳糖协同Aβ1-42构建AD细胞模型研究细叶远志皂苷的作用机制。利用MTT法确定最佳造模浓度及细叶远志皂苷给药浓度，台盼蓝染料排斥实验检测HT-22细胞死亡率;β-半乳糖苷酶染色检测HT-22细胞衰老情况;Mito-Tracker荧光标记观察HT-22细胞线粒体损伤程度;罗丹明123染色流式细胞术检测HT-22细胞的线粒体膜电位变化;比色法检测HT-22细胞超微量总ATP酶含量改变;微板法检测HT-22细胞LDH漏出水平。通过荧光染色，流式细胞术及WesternBlot等方法评价细叶远志皂苷对D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的海马神经细胞HT-22的增殖、线粒体氧化应激、calpain系统及铁死亡的影响，并且加入calpeptin抑制calpain的表达，检测HT-22细胞铁死亡相关蛋白和突触相关蛋白的表达变化，以及利用AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测细叶远志皂苷对HT-22细胞凋亡的影响。 结果:动物实验结果发现，细叶远志皂苷能改善D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的小鼠学习记忆下降和突触损伤。进一步地，细胞实验结果发现，与模型组相比，细叶远志皂苷（10、20、40μmol/L）也能显著提高D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的HT-22细胞存活率，降低β-半乳糖苷酶阳性表达，细叶远志皂苷对D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的HT-22细胞死亡和突触损伤具有保护作用，此外，D-半乳糖协同Aβ1-42诱导小鼠海马钙相关蛋白calpastatin,铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的表达降低，并增加钙相关蛋白m-calpain和铁死亡相关蛋白ACSL4的表达，然而这些变化在细叶远志皂苷给药处理后均被逆转。细叶远志皂苷通过抑制D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的神经细胞HT-22内钙超载，并调控calpain系统中m-calpain和calpastatin（其是胞内唯一抑制calpain活性的蛋白）的表达，增加D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的HT-22细胞内ATP酶活性，阻止线粒体膜电位下降，氧化应激损伤和铁死亡的发生。有趣的是，当加入calpain抑制剂calpeptin后并没有阻断细叶远志皂苷对铁死亡影响的效应，但能阻断D-半乳糖协同Aβ1-42诱导的HT-22细胞凋亡和突触损伤。 结论:这些结果表明，细叶远志皂苷在一定剂量范围内对D-半乳糖协同Aβ1-42损伤的HT-22细胞具有保护作用，其保护机制可能通过抑制海马神经元突触损伤、增强线粒体能量代谢、阻止线粒体氧化应激损伤、阻止铁死亡的发生、维持calpain系统稳定并抑制神经细胞凋亡从而改善小鼠学习记忆功能。这一发现指出了细叶远志皂苷针对神经退行性疾病包括AD的新治疗策略的潜在可能性。
NETL