摘要
体细胞重编程技术是再生医学的基础，如何高效率地获得具有高潜能的诱导多能干细胞(iPSC)是其走向大规模应用的关键。目前已经有多种不同的重编程体系被开发出来，但是其在效率和分化潜能上依旧存在提升的空间。开发具有高效率和高潜能的重编程系统，并对其多能性构建过程进行机制解析，无论是对医学应用还是基础研究都有巨大的帮助。 本论文基于高效的7因子(Jdp2、Kdm2b、Mkk6、Glis1、Nanog、Essrb、Sall4)重编程体系，通过优化诱导培养基，精简诱导因子，获得了效率相当，潜能相似的JGES(Jdp2、Glis1、Esrrb、Sall4)诱导体系，并使用多组学的分析方式，对其分子机制进行了研究。 通过与OKS(Oct4、Klf4、Sox2)系统的比较，发现JGES系统过程中会激活中胚层发育程序的相关基因，这些基因对染色质调控有着重要的影响。接着，使用单细胞转录组测序技术，对重编程中细胞的命运变化及其调控的转录因子图谱进行绘制。通过分析，本论文发现:在重编程前期，会激活原条形成的相关基因，随后部分细胞激活了中胚层发育的相关基因，并且伴随着EMT(EpithelialtoMesenchymal-likeTransition)相关基因的上调，最终形成间充质形态和T阳性的细胞分支;在这个系统中还会形成XEN-like(胚外内胚层)的细胞命运分支，但是其并非作为多能性的中间态出现;多能性建立的分支则经历了一个类似始发态(primed)向原始态(na?ve)状态的转变;此外，这个系统还特异性地出现了一个与多能性分支接近的，表达Pou5f1、Sox2、Lin28a的Cdx2阳性细胞分支。该体系中，大部分分支命运都在重编程的前三天形成，后期逐渐稳定。 在完成重编程中的细胞命运演变分析后，以此为基础，进一步研究了各个诱导因子的功能，发现4个诱导因子通过相互协作完成多能性的构建。其中，Sall4和Glis1是重编程的推动力，移除后大部分命运分支都无法形成;Esrrb主要发挥抑制作用，抑制非多能性分支形成的相关基因;Jdp2则行使沉默体细胞基因的功能。在染色质可及性的动态调控中，Sall4发挥着关键的作用。然而，Sall4自身没有确定的motif，发挥的功能严重依赖于其招募的蛋白。SALL4只有与OCT4、SOX2、NANOG等多能性相关的蛋白一起发挥功能时，才有利于多能性的构建。 此外，对诱导培养基中的GSK-LSD12HCl(LSD1抑制剂)和SGC0946(DOT1L抑制剂)两个小分子抑制剂的功能，以及BMP4对JGES重编程系统的影响也展开了探究，发现:GSK-LSD12HCl通过激活Sox2、Etv5、Nanog、Cdx1等多能性基因从而促进重编程，而SGC0946能够抑制GSK-LSD12HCl激活的Hox家族基因和EMT相关基因，从而消除其不利的影响。BMP4在JGES重编程系统的前期，能够抑制多能性基因的激活，从而阻断了多能性的建立，最终抑制了Cdx2阳性以及多能性的分支形成。过表达Oct4能够解除BMP4的阻断作用。 最后，结合了以上的分析数据，挑选了一些JGES重编程过程中多能性构建的相关基因，通过优化和筛选实验，建立了Zfp296、Tfap2c、Prdm14、Etv5、Sall1的新重编程体系，并且验证了其产生的iPSC也具有多能性。 本研究开发了一种新的重编程体系，并对其机制进行解析。作为一个完全不包含OKS诱导因子的重编程体系，JGES重编程的机制研究在体细胞重编程、细胞命运决定和多能性构建机制上提供了一些新的观点与认识。此外，本文的研究思路和方法，也可为其他重编程体系的机制分析策略提供一些参考。
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