摘要
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)属于冠状病毒科，α-冠状病毒属。PEDV感染后会导致猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)，这种病主要引起病猪严重的腹泻、呕吐和脱水等症状，并造成哺乳仔猪极高的死亡率，导致全球养猪业遭受巨大经济损失。冠状病毒基因组共编码十六种非结构蛋白，RNA依赖性RNA聚集酶(RdRp)是由非结构蛋白12编码的一种蛋白，它在病毒RNA合成与转录过程中起到了核心作用，是复制复合物的核心蛋白，用于表达位于复制酶基因下游的基因。本研究采用原核表达载体制备出了具有活性的RdRp蛋白，并以纯化的RdRp蛋白为抗原成功地生产出了抗RdRp多抗，同时将该多抗应用于益智仁多糖3(Alpiniaeoxyphyllaefructuspolysaccharide,AOFP3)抗PEDV的研究中。具体试验内容分为以下两部分: 1RdRp多克隆抗体制备及验证本试验通过大肠杆菌原核表达技术，从PEDVCV777毒株中成功地克隆出了RdRp基因，构建了重组表达载体pET28a(+)-RdRp并对其进行测序验证。然后，将其转入大肠杆菌重组菌株BL21体内，通过IPTG诱导方式进行重组表达，获得His-tag-RdRp融合蛋白并将其进行纯化，通过SDS-PAGE方法检测获得的蛋白。将纯化的RdRp蛋白经过浓度检测后与等体积弗氏佐剂进行乳化，然后背部多点皮下注射接种6周龄雌性家兔，于第四次免疫10天后进行心脏采血，分离血清纯化后得到抗RdRp兔多克隆抗体。对多抗进行纯化后，采用间接ELISA技术检测RdRp多抗的效价，同时采用WesternBlot和间接免疫荧光技术分析RdRp多抗的特异性。结果表明，重组载体测序结果显示与RdRp基因一致，说明本试验成功构建重组载体，SDS-PAGE结果显示重组菌BL21成功表达出目的蛋白，且纯化后只有单一条带，说明本试验成功制备并纯化了RdRp蛋白。间接ELISA结果显示本试验制备的兔多抗效价可达1:100000,效价较高，且能与PEDV中的RdRp及真核表达载体表达的RdRp特异性结合，证明其特异性良好。 2RdRp在AOFP3抗PEDV研究中的应用本试验以纯化后的RdRp蛋白为样品，以FITC标记的ployA为底物，纯化后的RdRp蛋白为聚合酶，通过检测反应物的吸光度及荧光值计算RdRp蛋白的活性，同时在反应体系中加入不同浓度的AOFP3,测定AOFP3对RdRp蛋白活性的影响。然后，将RdRp真核载体转染vero细胞，72小时后加入放线菌酮使RdRp蛋白停止表达，加入AOFP3后，分别于0、2、4、6、10和14小时用WesternBlot法检测其半衰期，分析AOFP3对RdRp蛋白活性的影响。结果表明，RdRp活性为2pmol/μg/h左右，且AOFP3可降低其活性并呈浓度依赖性;RdRp半衰期约为5.47小时，但AOFP3对RdRp半衰期无影响。 综上所述，本试验成功地制备了特异性良好的抗RdRp多克隆抗体，并将其用于了AOFP3抗PEDV研究中，为抗PEDV药物的筛选提供了良好的工具。
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