摘要
目的: 建立一种高效、敏感且特异的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫闭管核酸检测方法，并初步评价其用于我国血吸虫病重点水域流行区钉螺、哨鼠及人体感染检测的应用效果。 方法: 分别以日本血吸虫Sj28s和SjR2基因片段设计LAMP引物，选择LAMP扩增效果较好的片段设计相应gRNA和ssDNA探针，建立基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫闭管核酸检测方法并优化反应体系与温度。 用LAMP-CRISPR法检测10倍梯度稀释的日本血吸虫成虫的基因组DNA、含有相应靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒，日本血吸虫各发育阶段的基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等寄生虫的基因组DNA，评价其敏感性和特异性。 用LAMP-CRISPR法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本，并与LAMP法检测结果比较，以评价LAMP-CRISPR法用于检测感染性钉螺的应用效果。血吸虫尾蚴感染小鼠，感染情况分别为5、10、20、40条，于感染后第3～6周分别收集小鼠粪便并行虫卵镜检，同时提取小鼠粪便DNA分别进行荧光定量PCR、LAMP和LAMP-CRISPR方法检测并比较结果，以评价LAMP-CRISPR法检测粪便中血吸虫虫卵DNA的能力及效果。 采集洞庭湖区环境钉螺样本84份、监测点哨鼠粪便样本13份和湖北省人粪样本201份，分别采用显微镜检和荧光定量PCR、LAMP、LAMP-CRISPR等3种核酸检测方法进行血吸虫核酸检测并比较，对当前重点水域流行区血吸虫病感染风险进行评估，并对建立的方法进行初步应用评价。 结果: 根据LAMP扩增结果，选择反应速率较快，扩增效果较好的SjR2靶标片段建立基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫闭管核酸检测方法。其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA和Cas12a的最佳反应浓度均为40nM。 建立的日本血吸虫检测方法与肝片形吸虫等其它寄生虫基因组DNA均无交叉反应。以10倍梯度稀释的日本血吸虫成虫基因组DNA为模板，该方法检测限为1pg/μL;以10倍梯度稀释的重组质粒为模板，该方法检测限为10拷贝/μL。此外，该方法能够准确检测出日本血吸虫各发育阶段的基因组DNA。 45份钉螺样本检测结果显示,建立的LAMP-CRISPR法与现场常用的LAMP法检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(x2=0.05,P＞0.05),与现行的病原学标准方法比较，LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100％(15/15)，特异度为96.67％(29/30)，LAMP方法的灵敏度为100％(15/15),特异度为93.33％(28/30)。感染小鼠检测结果显示，LAMP-CRISPR法最早能够检测到感染后第4周，感染10条尾蚴小鼠粪便中虫卵DNA,与LAMP法检测结果一致，而荧光定量PCR最早能够检测到感染后第4周，感染40条尾蚴小鼠粪便中虫卵DNA,表明LAMP-CRISPR在检测小鼠早期感染方面具有优势。 对2022年洞庭湖区84份环境钉螺样本、对应监测点13份哨鼠粪便样本和湖北省201份人粪样本进行镜检及3种核酸方法检测，结果均未发现阳性样本。 结论: 本研究建立了一种基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫闭管核酸检测方法，该方法敏感性高、特异性强，在检测人体来源的生物样本、中间宿主以及环境病原体均具有可行性，在检测环境感染钉螺及小鼠早期感染方面均具有较好的效能且存在优势。
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