摘要
牙齿发育是一个多种细胞相互作用协调进行的一个复杂而高度有序的生物学过程。不同物种的牙齿形态各异，具有不同的发育机制。哺乳动物如人类和啮齿动物类牙齿发育具有较高的相似性，因而可以通过啮齿动物模型研究人类牙齿发育机制和疾病发生原因。成牙本质细胞和成釉质细胞这两类高度分化的极性细胞，是牙齿发育过程中非常重要的功能性细胞，分别形成牙本质和牙釉质。牙本质和牙釉质等特殊的坚硬组织中主要包含两类蛋白质，胶原蛋白质和非胶原蛋白质，胶原蛋白质所形成的胶原纤维是牙本质和牙釉质的基质骨架，而非胶原蛋白质尽管含量相比胶原蛋白质低，却在坚硬组织矿化的形成和稳定过程中发挥重要的作用。 DSPP蛋白质作为在成牙本质细胞中特异表达的重要非胶原蛋白质，参与牙本质形成和矿化。现有知识认为DSPP蛋白质在体内合成后迅速被切割形成DSP和DPP两个成熟蛋白质发挥功能。人类已报道的多种牙本质发育疾病与DSPP基因相关，主要可以分为两大类，牙本质发育不全和牙本质发育不良，其中牙本质发育不全Ⅱ型和Ⅲ型以及牙本质发育不良Ⅱ型是由于DSPP基因突变引起。牙本质发育不全Ⅱ型是一种常见的显性遗传牙本质发育异常疾病，连锁分析揭示了与该疾病相关的多个不同形式的DSPP突变。我们对一个牙本质发育不全Ⅱ型家族进行全基因组测序和连锁分析发现一个与之前已有报道相同的DSPP基因c.135+1G＞A突变。目前已有的关于DSPP蛋白质功能研究的的小鼠模型大多是DSPP基因纯和敲除或者DSP/DPP蛋白质转基因模型，几乎没有精确模拟人类DSPP基因突变的小鼠模型。因此，我们尝试利用实验室建立的类精子干细胞介导半克隆技术，构建携带致病突变位点的小鼠模型。由于该突变位点同时也有c.135+1G＞T的突变形式，我们构建了两种突变形式的小鼠模型(c.144+1G＞A和c.144+1G＞T),这两种模型小鼠均表现出牙本质发育不全Ⅲ型的疾病表型，主要表现在牙髓腔扩大、牙本质层变薄和牙本质总体体积减少。逆转录PCR分析显示，G＞A和G＞T突变均会导致转录本中完全缺失3号外显子，从而验证了一直存在的在人类DSPP基因3号内含子剪切供体位点的G＞A突变可能会导致3号外显子跳跃剪切的假设。 由于缺乏高质量的DSPP蛋白质的抗体以及识别DSP和DPP的抗体，为了能分别标记DSPP全长蛋白质以及切割后的两个成熟蛋白，我们在携带野生型和突变型Dspp的类精子干细胞的Dspp基因5''端和3''端分别插入Flag和HA标签序列，进而通过卵子注射一步构建相应的标签小鼠模型。通过对标签小鼠的野生型和突变型DSPP/DSP/DPP蛋白质在体内发育过程中表达模式的分析，我们发现DSPP全长蛋白质在体内长期大量稳定存在。免疫组化分析揭示了DSPP突变蛋白质对成牙本质细胞造成的显性突变效应是小鼠牙本质发育异常的原因:突变的DSPP蛋白质在牙齿发育早期（P0-P7）与野生型DSPP蛋白质一样，可以稳定表达和被切割，而在牙齿发育后期（1月龄后），DSPP突变蛋白质相对野生型小鼠有明显累积，突变小鼠中的成牙本质细胞形态和数量均发生异常。此外，两种加标签的突变小鼠在疾病上尽管显示出相似的表型，但是G＞A却比G＞T突变小鼠表型更加严重。在RNA表达上，G＞A突变小鼠中突变的DsppRNA表达水平高于G＞T突变小鼠，进而导致G＞A中突变蛋白质累积更加严重;而两种突变小鼠中RNA水平的差异可能是两种不同形式的碱基突变对跳跃剪切事件发生的效率的影响不同。 对于DSPP突变蛋白质所造成的显性突变效应，我们进一步通过转录组测序揭示了G＞A/T的突变小鼠中细胞内脂质转运和免疫反应相关的基因转录水平的上调。对成年小鼠中的牙髓组织油红染色检测到G＞A突变小鼠中油滴的积累，证明由于DSPP突变蛋白质对于成牙本质细胞的脂质运输的影响导致了成牙本质细胞中脂质积累直至产生大量脂滴。脂质组的质谱结果揭示了G＞A的突变小鼠牙髓中脂滴的成分，同时脂质组质谱检测到甘油三脂和鞘脂等脂滴膜相关的脂质的富集，佐证了脂滴的存在。此外，伴随成牙本质细胞脂质代谢失调出现的还有成牙本质细胞极性的丧失和牙齿发育后期牙齿组织中上调的免疫反应。 综上，Dspp两种点突变小鼠均表现出人类牙本质发育不全Ⅲ型疾病表型。Dspp野生型标签小鼠揭示全新的DSPP蛋白质表达模式，而突变型标签小鼠在体内证明了DSPP突变蛋白质的显性突变效应。突变小鼠中成牙本质细胞脂质代谢的紊乱、细胞极性的异常以及炎症反应的上调相互加剧导致成牙本质细胞功能的异常，最终表现在成牙本质细胞极性完全丧失，极性异常的成牙本质细胞数量增加和细胞中脂滴的积累，这些细胞层面的变化解释了突变小鼠中牙本质层变薄和牙髓腔增大的表型。
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