摘要
目的:以胶质母细胞瘤(GBM)为代表的高级别胶质瘤对人体造成了极大的危害，规范的手术治疗联合术后放化疗使GBM的5年生存期仍不足10％，这给人体健康造成了巨大威胁。随着分子生物学技术的进步，以传统组织病理学为基础的诊断标准正在经受着巨大的考验，以分子病理为诊断基础的变革正在发生。随着2016年中枢神经系统肿瘤分类的发布，胶质瘤的分子病理诊断对指导临床神经外科诊疗行为起到了重要作用。尽管如此，胶质瘤的治疗进展仍然十分有限，针对胶质瘤发病的分子机制及治疗靶点的探索从未停止。液泡ATP酶(VacuolarATPase,V-ATPase)是一类大分子复合物，在肿瘤中的作用被广泛探索。但是针对它的特异性亚基在胶质瘤中的作用和机制的研究仍很有限.T细胞免疫调节因子1(Tcellimmuneregulator1,TCIRG1)是V-ATPase的V0a3亚基，参与介导V-ATPase在肿瘤细胞膜上定位分布和一系列恶性生物学行为的调节，但是它在胶质瘤中的作用尚无相关报道.本文初步阐明该因子与胶质瘤恶性表型的关系，进一步探索了该因子对胶质瘤恶性生物学行为的调控和相关机制。 研究方法:1、应用生物信息学分析，获取TCGA、CGGA和GEO数据库胶质瘤患者的转录数据，初步明确TCIRG1基因在胶质瘤不同的病理分级、组织类型、临床及分子表型中的表达情况，并阐明其表达与胶质瘤患者总体生存期的关系，通过多因素Cox回归分析确定TCIRG1高表达是胶质瘤不良预后的独立性危险因素。2、使用临床样本及细胞系(U251、U87、U118、LN229和NHA)验证TCIRG1在体内和体外的表达情况。3、建立稳定的转染后敲减和过表达TCIRG1的胶质瘤细胞系。4、采用CCK-8、EdU、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell基质胶侵袭实验测定干扰TCIRG1表达后对胶质瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭能力的影响.5、采用流式细胞实验和Tunel实验检测敲减及过表达TCIRG1后对胶质瘤细胞凋亡的影响，应用WesternBlot(WB)检测干扰TCIRG1表达后对凋亡相关蛋白表达的影响.6、采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)计算胶质瘤的缺氧、血管生成和上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的富集评分，通过相关性分析初步明确TCIRG1表达与上述评分的密切相关性.7、通过构建缺氧的细胞培养环境，研究TCIRG1对胶质瘤相关生物学过程的影响。检测缺氧对TCIRG1与EGFR、HIF1A表达的影响，通过免疫共沉淀(CO-IP)实验检测TCIRG1与EGFR、HIF1A的共表达情况.使用WB和免疫荧光实验验证了干扰TCIRG1表达后胶质瘤细胞系EMT标志物的变化，通过加入EGFR抑制剂和过表达HIF1A研究TCIRG1通过EGFR/HIF1A轴对胶质瘤EMT过程的影响.8、WB实验验证缺氧环境下通过干扰TCIRG1表达对PI3K/Akt/mTOR通路中关键分子标志物表达的影响;使用EGFR抑制剂，验证TCIRG1通过调控EGFR介导调控PI3K/Akt/mTOR通路，从而发挥致癌作用.9、通过加入PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂，验证TCIRG1通过该通路对胶质瘤恶性生物学行为的影响.10、通过裸鼠皮下成瘤实验，检测干扰TCIRG1表达后，胶质瘤细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化.并取肿瘤标本，通过免疫组化和WB分析，探索肿瘤组织中EMT相关指标、Ki-67和VE-cadherin等的变化.11、WB实验检测缺氧条件下干扰TCIRG1表达后胶质瘤细胞系血管生成和拟态标志物的变化.12、使用GraphpadPrism7.0和R软件(版本3.6.3)进行作图和统计.采用t检验或ANOVA分析进行组间比较，Log-rank检验进行生存分析，使用Pearson或Spearman相关系数分析进行相关性研究.统计结果中P＜0.05为差异具有统计学意义. 结果:1、通过对TCGA、CGGA和GEO数据库中的脑胶质瘤测序数据进行生物信息学分析，结果显示TCIRG1在胶质瘤中的表达高于正常脑组织，而WHOⅣ级胶质瘤中表达最高.TCIRG1高表达能够反映胶质瘤不同的恶性生物学表型，在IDH野生型、1p19q非联合缺失型、高龄(＞60岁)和MGMT非甲基化组胶质瘤中的TCIRG1表达明显增高.此外，TCIRG1在间质型GBM中明显高表达，可能是诊断间质型GBM的有效指标.2、通过免疫组化实验验证在人WHOⅣ级胶质瘤组织中TCIRG1明显高表达.同时，我们使用RT-PCR和WB验证了TCIRG1的表达量在胶质瘤细胞系中高于正常星形细胞系.3、TCIRG1高表达提示不同胶质瘤临床及分子表型的不良预后，同时是胶质瘤放化疗后预后不良的重要指标.4、一致性聚类分析显示TCIRG1结合其他4个V-ATPase编码基因(ATP6AP1、ATP6AP2、ATP6V1C2和ATP6V1G2)的转录表达能够将胶质瘤分为不同预后与临床表型的2种亚型，其中C2亚型预后更差，伴有肿瘤相关通路及免疫通路的激活.基因本体论(GeneOntology,GO)和KEGG通路分析提示，TCIRG1可能参与胶质瘤多种生物学通路的调控.5、经CCK-8、克隆形成、EdU、划痕愈合和Transwell实验证实，干扰TCIRG1表达后明显影响胶质瘤细胞系的增殖、迁移、侵袭的能力.裸鼠体内成瘤实验同样证实了高表达TCIRG1能够促进胶质瘤的增殖能力.6、Tunel和流式细胞实验显示干扰TCIRG1表达后影响胶质瘤的凋亡过程，敲减TCIRG1表达后凋亡促进蛋白Caspase-3、PARP1、Bax表达增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低;过表达TCIRG1则下调Caspase-3、PARP1、Bax表达，而Bcl-2表达增加.7、IvyGAP数据库分析显示TCIRG1在GBM不同解剖区域内的转录水平有所差异，在肿瘤血管增生区和微血管增殖区域内明显高表达。GSEA显示TCIRG1高表达的胶质瘤患者伴有血管生成(Angiogenesis)、上皮间充质转化(EMT)、缺氧(Hypoxia)通路的激活.通过ssGSEA构建胶质瘤患者血管生成、上皮间充质转化、缺氧过程的富集评分,TCIRG1表达与上述评分有明显正相关性。8、缺氧环境下干扰TCIRG1的表达明显影响胶质瘤的EMT过程.WB和免疫荧光实验证实敲减TCIRG1表达后EMT过程抑制性标志物蛋白E-cadherin表达上调，而促进EMT过程的标志蛋白N-cadherin、Vimentin、ZEB1表达下调;反之，则E-cadherin呈现表达下调，而N-cadherin、Vimentin、ZEB1蛋白表达呈现上调。裸鼠体内实验结果与上述结果一致.9、缺氧环境下，过表达TCIRG1后上调EGFR和HIF1A的表达，反之则下调二者表达;CO-IP实验证实TCIRG1与EGFR有蛋白互作关系，EGFR抑制剂能够阻断TCIRG1过表达后对HIF1A的上调作用。10、缺氧环境下，TCIRG1通过EGFR/HIF1A轴调控胶质瘤细胞系的EMT过程;TCIRG1通过EGFR调控PI3K/Akt/mTOR通路中关键蛋白的表达。11、缺氧环境下TCIRG1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节胶质瘤的增殖、迁移、凋亡过程.12、下调TCIRG1表达后影响胶质瘤血管生成标志分子CD31的表达。TCIRG1的表达与血管拟态标志物明显呈正相关，TCIRG1通过HIF1A调节胶质瘤血管拟态标志物VE-cadherin的表达. 结论:1、TCIRG1在人脑胶质瘤组织中高表达并与肿瘤恶性程度正相关，可能是胶质母细胞瘤(GBM)间质亚型的特异性标志物，其高表达提示胶质瘤患者的预后不良;2、TCIRG1高表达能促进入脑胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭的能力，抑制胶质瘤凋亡的发生;3、缺氧环境下，TCIRG1能够通过EGFR/HIF1A轴调控胶质瘤的EMT过程和血管拟态形成;4、缺氧条件下，TCIRG1通过EGFR调控PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键蛋白的表达.PI3K/Akt/mTOR通路是TCIRG1调控胶质瘤恶性生物学行为的重要通路之一.
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