摘要
烟草(NicotianaTabacumL.)是我国一种重要的经济农作物。然而，烟草生长过程中会长期受到多种胁迫，包括营养元素缺乏，高温、干旱、高盐等非生物胁迫和病害、虫害、杂草等生物胁迫，其中钾限制是影响烟草生长和烟叶品质的重要因子。为了缓解化学性肥料带来的一系列生态环境问题，克服非生物与生物胁迫，本论文基于烟草“中川208”，分析了叶际与根际土壤的微生物多样性与群落组成;结合传统平板分离技术，挖掘高效、优质和抗逆性强的促生钾细菌，选育具有功能互补性、作物亲和性和地域适应性的功能菌株;并采用盆栽根灌试验，基于转录组与蛋白组学分析技术，探讨功能菌株对土壤难溶性钾的释放潜能，探究钾细菌参与宿主植物钾吸收与转运、促进植物生长的分子机制。本研究一方面为挖掘烟草解钾、促生储备菌种，扩大微生物资源宝库提供了贡献;另一方面，为新型微生物钾肥在烟草种植业中的应用，减少化肥农药使用，促进我国绿色农业可持续发展和微生物资源的农业应用提供了重要的参考依据。本论文主要研究结果如下: 1.不同植烟区烟草叶际与根际土壤的微生物多样性与群落组成差异显著 在细菌和真菌群落中，根际土壤的Chao1和Shannon指数显著最高，而Good''scoverage指数显著最低(p＜0.01)，表明根际土壤的优势微生物菌群在群落组成与组织装配中发挥着关键作用。细菌群落中，会东县和米易县根际土壤的优势微生物均为假单胞菌属、根瘤菌属和鞘氨醇菌属;叶际的细菌群落组成在区域水平和叶龄上存在显著差异:其中泛菌属和肠杆菌属为会东县烟草老叶的优势菌群，而拟杆菌属主要富集于新叶中;不动杆菌属和金黄杆菌属为米易县烟草老叶的优势菌群，而Lechevalieria和贪噬菌属主要富集于新叶中。共现网络分析的结果表明，变形菌门(Alpha变形菌纲)对细菌微生物群落的组织装配和整体功能优化具有关键作用。真菌群落中，Cyberlindnera、Fusarium和Mortierella为米易县烟草叶际和根际土壤的优势菌群，而会东县微生物的群落组成差异显著，这种差异的优势微生物菌群一定程度上导致了其代谢功能潜能的差异。冗余分析的结果表明，烟叶氮、钾、总糖含量和日最高温是影响叶际优势微生物菌群分布的关键环境驱动因子(r2＞0.5,p＜0.05)。 2.钾细菌的体外功能活性存在显著差异 从烟草叶际和根际土壤筛选的钾细菌主要为肠杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、泛菌属和克雷伯氏菌属。体外分析结果表明，霍氏肠杆菌(EnterobacterhormaecheiPTG11)、类芽孢杆菌(PaenibacillusSKL51)和产酸克雷伯氏菌(KlebsiellaoxytocaSKT41)的5天累计溶钾量显著最高，分别为9.92、9.75和8.34μg/mL,与空白组相比钾含量增加率分别为61.47％、58.02％和41.84％;且菌体溶钾量与有机酸分泌量呈显著正相关。路德维希肠杆菌(E.ludwigiiSKB31)5天的累计溶磷量显著最高，为521.09μg/mL;E.roggenkampii(PTG72)分泌的IAA含量显著最高，为158.10μg/mL;巨大芽孢杆菌(BacillusmegateriumJDL11)分泌的铁载体含量显著最高，为59.00μg/mL;对病原真菌弯孢菌的抗性分析表明，东洋芽孢杆菌(B.toyonensisTTB08)的抑菌效果最显著，抑菌圈为33.68mm;且上述钾细菌对重金属Cd的富集与耐受能力显著不同。综上发现,霍氏肠杆菌(E.hormaecheiPTG11)、类芽孢杆菌(PaenibacillusSKL51)、路德维希肠杆菌(E.ludwigiiSKB31)、巨大芽孢杆菌(B.megateriumJDL11)和E.roggenkampii(PTG72)在功能活性中具有一定互补性，为本研究筛选出的储备植物益生菌。 3.不同钾细菌处理下的烟草农艺性状与养分含量差异显著 盆栽实验的分析结果表明，单菌B1(E.hormaecheiPTG11)和B2(PaenibacillusSKL51)处理下的烟草株高显著最高，分别为92.0和98.0cm;且B1处理下的烟叶Ca和Mg含量显著最高，分别为46.16和5.91mg/gDW;而有害元素Cd和Cl含量显著最低，分别为0.93mg/kgDW和6.21mg/gDW。混菌B3(E.hormaecheiPTG11+E.ludwigiiSKB31)处理下的烟株地上干重显著最高，为152.32g/株DW;同时B3处理显著提高了土壤水溶性钾和交换性钾含量，且烟叶中的K和Mn含量显著最高，分别为27.32和64.76mg/kgDW。混菌B5(E.hormaecheiPTG11+B.megateriumJDL11)处理下的根系活力显著最高，为0.63mg/(g·h);此外，不同钾细菌处理下的烟叶N、P、Na、Fe、淀粉、还原糖和纤维素等含量也存在显著差异。综上发现，钾细菌E.hormaecheiPTG11在促进烟株生长，释放与活化土壤难溶性钾，提高烟株钾有效性和其它养分累积等方面具有显著优势。 4钾细菌E.hormaecheiPTG11显著影响烟草生长和养分离子吸收与跨膜转运 通过IlluminaNovaSeq6000测序，发现上调的生长调控基因有62个，包括11个分生组织调控基因、27个营养器官调控基因(根系发育/根表皮细胞分化、茎系统形态发育和叶片发育)和15个生殖系统发育调控基因(花卉/花粉发育和果实发育)。钾细菌E.hormaecheiPTG11介导下，烟草体内的钾离子跨膜转运蛋白显著上调表达的有:Shaker钾通道蛋白家族(AKT1、AKT2、AKT3、KAT3和SKOR)、双孔钾通道蛋白家族(TPK1、TPK3、TPK5)、HAK和KUP钾离子转运蛋白家族(HAK1、HAK5、HAK10、HAK11和KUP)和高亲和力钾转运蛋白。同时，钙离子、镁离子、氯离子和其它过渡金属离子的跨膜转运蛋白也显著上调表达，而钠离子转运蛋白HKT1显著下调表达。 5钾细菌E.hormaecheiPTG11显著影响植物的代谢功能与抗病性 钾细菌Ehormaechei作用下，显著影响了烟株的碳水化合物代谢（淀粉和蔗糖代谢）、氨基酸代谢、氮代谢、激素代谢和萜类、（类）黄酮、玉米素和链霉素等次级代谢产物的生物合成;且显著影响了植物钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路和Apelin信号通路中的关键调控基因与蛋白。同时，本研究认为钾诱导的代谢物模式与烟株疾病发病率之间存在相关性。在钾细菌Ehormaechei介导下，烟株对病原体的抗性和防御能力增强，其中抗病蛋白TAO1、RPP13-4、RPM1、RGA2和RF9显著上调表达。另外，发现的防锈激酶Lr10、对细菌的防御反应、对真菌的防御反应和对卵菌的防御反应等通路途径，进一步表明了钾素对增强植物的防御应激反应具有重要意义。
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