摘要
目的:化疗和光动力治疗（PDT）联用抗乳腺癌具有优势，但单药联合后存在溶解度差，生物利用度低等问题，本课题构建双载药靶向纳米制剂PDA-Ce6-BUF/HANPs,包括中药抗肿瘤活性成分蟾毒灵（BUF）、光敏剂Ce6以及靶向分子透明质酸钠（HA）。PDA-Ce6-BUF/HANPs不仅增强BUF和Ce6的肿瘤靶向共递送，而且能够通过BUF下调肿瘤乏氧因子（HIF-1α）,增强PDT抗乳腺癌作用。 方法:（1）通过紫外分光光度法以及高效液相色谱法（HPLC）分别建立Ce6和BUF的含量测定方法;对制剂进行工艺考察，考察因素包括不同药辅比、不同搅拌时间、不同质量比，通过考察不同条件下粒径、PDI、载药量和包封率，确定制备PDA-Ce6-BUF/HANPs的方法。（2）通过TEM、紫外、荧光等对制剂进行表征;考察PDA-Ce6-BUF/HANPs在不同的介质的稳定性;在不同pH溶液中考察PDA-Ce6-BUF/HANPs的体外释放能力。（3）通过激光共聚焦和流式细胞术，考察PDA-Ce6-BUF/HANPs的细胞摄取能力，证明其肿瘤靶向能力;采用CCK8法考察BUF和Ce6在MCF-7细胞中的协同抑制细胞增殖作用;利用AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒考察纳米制剂的诱导细胞凋亡能力。（4）分别通过DPBF和DCFH-DA荧光探针证明PDA-Ce6-BUF/HANPs在体外溶液和细胞中产生ROS的能力;通过免疫荧光考察PDA-Ce6-BUF/HANPs对HIF-1α表达的调控能力。（5）通过溶血实验，评价PDA-Ce6-BUF/HANPs的血液安全性;建立MCF-7细胞皮下瘤模型，通过小动物活体成像，系统观察PDA-Ce6-BUF/HANPs的体内分布，并通过抑瘤率、瘤重等评价纳米制剂的体内抗乳腺癌药效;通过HE染色评价纳米制剂的安全性。（6）通过HIF-1α抗体和DCFH-DA荧光探针染色观察瘤内HIF-1α的表达和ROS产生，证明制剂增强PDT抗乳腺癌的作用机制;通过Tunel和Ki67检测肿瘤组织的损伤情况。 结果:（1）PDA-Ce6-BUFNPs粒径为117.07±1.1nm,PDI为0.27±0.03,电位为-34.23±0.81mV,BUF和Ce6包封率分别为42.74±0.13％和61.17±0.08％,载药量分别为0.17±0.00％和4.83±0.01％。（2）PDA-Ce6-BUF/HANPs形态呈近球形，其紫外光谱中有Ce6、PDA的特征吸收峰，荧光光谱中有Ce6的特征荧光;PDA-Ce6-BUF/HANPs在7天内粒径、PDI以及电位无明显变化，说明制剂稳定性良好;体外药物释放实验表明，PDA-Ce6-BUF/HANPs在pH5.0介质中，BUF和Ce6的累积释放率分别是pH7.4下累积释放率的1.26、1.2倍，说明其释药具有pH响应性。（3）PDA-Ce6-BUF/HANPs在MCF-7细胞中的摄取具有时间依赖性，与PDA-Ce6-BUFNPs相比，PDA-Ce6-BUF/HANPs的细胞摄取率更高;过量HA孵育后PDA-Ce6-BUF/HANPs的细胞摄取减少，证明PDA-Ce6-BUF/HANPs通过HA与细胞表明CD44受体结合增加细胞胞吞;Ce6和BUF在摩尔比为5∶1-20∶1时具有协同作用，且在摩尔比为10∶1时，协同作用最强;细胞毒实验结果表明，光照后PDA-Ce6-BUF/HANPs较游离药和其它制剂组，在MCF-7细胞上的细胞毒性最强;相比于游离Ce6、BUF以及PDA-Ce6-BUFNPs组，光照后PDA-Ce6-BUF/HANPs诱导MCF-7细胞凋亡能力最强。（4）PDA-Ce6-BUF/HANPs在常氧/乏氧条件下，较其他组具有更强的产生ROS的能力，能明显的降低细胞内HIF-1α表达。（5）PDA-Ce6-BUF/HANPs在体内给药浓度下溶血率低于5％,可用于静脉注射;体内分布实验中，PDA-Ce6-BUF/HANPs较游离Ce6和PDA-Ce6-BUFNPs,能增强药物在肿瘤部位的蓄积能力;体内抗乳腺癌药效评价的结果表明，PDA-Ce6-BUF/HANPs组在光照后的抑瘤率达到76.00％,具有最强的抗肿瘤作用;不同器官组织切片结果证明PDA-Ce6-BUF/HANPs生物安全性良好。（6）通过测定PDA-Ce6-BUF/HANPs肿瘤组织HIF-1α和ROS表明，BUF能降低HIF-1α和VEGF表达，进一步增强Ce6的PDT作用。 结论:本课题首次制备了共载中药活性成分BUF以及光敏剂Ce6的靶向纳米制剂PDA-Ce6-BUF/HANPs,其粒径均一，包封率与载药量高，稳定性好，释药具有pH响应性。在细胞水平，PDA-Ce6-BUF/HANPs具有CD44受体靶向性，能够提高在肿瘤细胞的摄取，BUF与Ce6不仅具有协同作用，而且BUF可通过下调肿瘤细胞内HIF-1α,从而提高PDT抗肿瘤作用;PDA-Ce6-BUF/HANPs具有良好的血液安全性，体内给药后，PDA-Ce6-BUF/HANPs能够主动靶向至肿瘤部位，提高药物在肿瘤的蓄积，发挥协同抗乳腺癌的作用，实现了中药活性成分和PDT联合治疗抗乳腺癌。
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