摘要
目的:本课题使用仿血流细胞共培养仪器建立血流剪切力下的血管内皮细胞和巨噬细胞共培养模型，旨在探讨剪切力作用对共培养体系中巨噬细胞极化表型与功能的影响及作用机制。 方法: 1.剪切力对共培养系统中巨噬细胞极化的影响:建立血管内皮细胞C166和巨噬细胞Raw264.7共培养体系，剪切力处理24小时，收集上层的巨噬细胞和培养基上清液。采用Calcein/PI染色检测细胞存活率，Westernblot检测M1/M2型标志物iNOS、Arg1表达，RT-qPCR检测M1/M2型标志物及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、Mrc1、Arg1、IL-10mRNA的表达，ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白的表达，细胞免疫荧光检测巨噬细胞CD86/CD163荧光信号的表达。 2.剪切力对内皮细胞炎症因子表达的影响:建立C166和Raw264.7共培养体系，剪切力处理24小时，收集下层血管内皮细胞及培养基上清液，采用RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10mRNA的表达，ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白的表达。 3.内皮来源IL-6对巨噬细胞极化作用的探讨:（1）C166细胞经LMT-28预处理后，与Raw264.7建立共培养体系，（2）Raw264.7细胞经si-IL6R转染后，与C166细胞建立共培养体系;剪切力处理24小时，收集巨噬细胞及培养基上清液。Westernblot检测iNOS、Argl、STAT3、p-STAT3、KLF4蛋白的表达，RT-qPCR检测STAT3、KLF4mRNA的表达，ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白的表达，细胞免疫荧光检测巨噬细胞CD86/CD163荧光信号的表达。 4.STAT3/KLF4通路对巨噬细胞极化的作用机制探讨:（1）Raw264.7经Stattic预处理后，（2）Raw264.7经si-KLF4转染后，分别与C166建立共培养体系;剪切力处理24小时，收集巨噬细胞及培养基上清液。采用Calcein/PI染色检测细胞存活率，Westernblot检测iNOS、Arg1、STAT3、p-STAT3、KLF4蛋白的表达，RT-qPCR检测STAT3、KLF4mRNA的表达，ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白的表达，细胞免疫荧光检测巨噬细胞CD86/CD163荧光信号的表达。 结果: 1.Calcein/PI染色结果示，static与shearstress组细胞存活率（存活率=活细胞/（活细胞+死细胞））无明显差异，Westernblot结果显示:与static组比较，shearstress组Arg1蛋白表达水平升高，iNOS在两组间比较无差异。RT-qPCR结果显示:与static组比，shearstress组Mrc1、Arg1、IL-10mRNA表达升高，iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平两组间无差异。ELISA结果示，与static组比较，shearstress组IL-10表达升高，TNF-α、IL-1β、IL-6表达无明显差异。免疫荧光染色显示，与static比较，shearstress组CD163荧光信号强度升高，CD86无明显差异。 2.RT-qPCR结果示，与static组比较，shearstress组IL-6、IL-10mRNA表达升高，TNF-α、IL-1β表达无明显差异，ELISA结果示，与static组比较，shearstress组IL-6表达升高，TNF-α、IL-1β、IL-10在两组间表达无明显差异。 3.（1）使用LMT-28抑制内皮细胞IL-6蛋白功能Westernblot结果示:shearstress+DMSO与static+DMSO组比较时，Arg-1、KLF4、STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT3表达升高，而shearstress+LMT-28组与shearstress+DMSO组比较时，Arg-1、KLF4、STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT表达降低，而iNOS的表达水平在各组间无明显变化。RT-qPCR结果示，shearstress+DMSO组与static+DMSO比较时，STAT3、KLF4mRNA表达水平均升高，而shearstress+LMT-28组与shearstress+DMSO组比较时，STAT3、KLF4mRNA表达水平均降低。ELISA结果示，shearstress+DMSO与static+DMSO比较时，IL-10表达水平升高，而shearstress+LMT-28组与shearstress+DMSO组比较时，IL-10的表达水平则降低，而TNF-α、IL-1β、IL-6在shearstress+DMSO、static+DMSO、shearstress+LMT-28三组间未见明显差异性改变。细胞免疫荧光结果示，shearstress+DMSO组与static+DMSO比较时，CD163荧光信号明显增加，而shearstress+LMT-28组与shearstress+DMSO组比较时，CD163荧光信号强度减弱，而CD86荧光信号强度在四组间则无明显差异。（2）敲低巨噬细胞IL6R基因，Westernblot结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-IL6R组Arg1、STAT3、p-STAT3、KLF4、p-STAT3/STAT3表达均降低，而iNOS的蛋白表达在两组间未见明显差异。RT-qPCR结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-IL6R组STAT3、KLF4mRNA表达水平均降低。ELISA结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-IL6R组IL-10的表达量下降，而TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平在两组间无差异。免疫荧光结果示:与si-NC组相比，si-IL6R组巨噬细胞CD163的荧光信号减弱，而CD86荧光信号强度在两组间无明显差异。 4.（1）Stattic干预处理Raw264.7,Calcein/PI细胞染色结果示，两组细胞存活率无明显差别。Westernblot结果示，与shearstress+DMSO组比，shearstress+stattic组的巨噬细胞Arg1、KLF4蛋白的表达水平均下降，而iNOS蛋白的表达水平在两组间无差异。RT-qPCR结果示，与shearstress+DMSO组比，shearstress+stattic组KLF4mRNA表达下降。ELISA结果示，与shearstress+DMSO组比，shearstress+stattic组的IL-10蛋白的表达水平下降，而两组间TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平无差别。细胞免疫荧光结果示，shearstress+DMSO组比，shearstress+stattic组的巨噬细胞CD163的荧光信号减弱，而CD86的荧光信号强度在两组间无差异。 （2）敲低Raw264.7KLF4基因的表达，Westernblot结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-KLF4组Arg1、KLF4蛋白的表达水平降低，而iNOS、STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT3表达在两组间无明显差异。RT-qPCR结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-KLF4组STAT3mRNA表达水平无明显差异。ELISA结果示，与shearstress+si-NC组比较，shearstress+si-KLF4组IL-10蛋白的表达水平下降，同时TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平在两组间无明显差异。细胞免疫荧光结果示，与shearstress+si-NC组比，shearstress+si-KLF4组的巨噬细胞CD163的荧光信号减弱，而CD86的荧光信号强度在两组间无差异。 结论:高剪切力能够促进巨噬细胞向M2极化;高剪切力促进血管内皮细胞分泌IL-6;血管内皮细胞来源的IL-6通过激活巨噬细胞STAT3/KLF4信号通路来调控巨噬细胞M2极化。通过改变IL-6、IL-6R、STAT3、KLF4的基因表达水平或蛋白功能，进一步证实了高剪切力通过内皮细胞来源的IL-6靶向巨噬细胞STAT3/KLF4信号通路来调控巨噬细胞M2极化。
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