摘要
目的:乳腺癌现已成为全球发病率最高的癌症。盐酸阿霉素是用于乳腺癌治疗的一线化疗药物，但肿瘤耐药性严重制约了其临床应用。近年研究显示，肿瘤耐药性与化疗药物对癌细胞的氧化应激损伤密切相关。许多中药功效成分具有抗氧化活性，其对放、化疗的“增效减毒”作用已经成为抗肿瘤研究领域的热点。因此，本课题拟基于敏感及耐药乳腺癌细胞在氧化还原状态方面的差异，探讨中药功效成分柴胡皂苷D与盐酸阿霉素联用的抗耐药乳腺癌作用及相关机制，为柴胡皂苷D抗耐药肿瘤的临床应用提供理论依据。 方法:通过检测乳腺癌敏感及耐药细胞线粒体形态，氧化应激产物活性氧水平、抗氧化物质谷胱甘肽、NADPH、NADH含量以及抗氧化应激关键转录因子Nrf2蛋白表达水平，比较两者氧化-还原体系状态的差异;采用细胞毒性实验和外排蛋白表达实验确证乳腺癌耐药细胞的耐药性。在此基础上，采用细胞集落形成、3D肿瘤球生长抑制、细胞凋亡等体外细胞实验考察柴胡皂苷D增强盐酸阿霉素对耐药乳腺癌细胞的生长和增殖抑制作用;建立MCF-7/ADR耐药细胞的荷瘤裸鼠皮下移植瘤模型，考察柴胡皂苷D与盐酸阿霉素的体内协同抗肿瘤作用。以细胞内ATP浓度、活性氧含量、谷胱甘肽浓度、NADPH浓度、NADH浓度、线粒体膜电位等为考察指标，探讨柴胡皂苷D对乳腺癌耐药细胞氧化-还原体系的调控作用;并从氧化应激角度考察柴胡皂苷D对耐药乳腺癌细胞周期、盐酸阿霉素摄取以及P-gp蛋白表达等方面的影响;以全面探究柴胡皂苷D抗耐药乳腺癌的作用机制。 结果:MDA-MB-231/DOX细胞和MCF-7/ADR细胞对盐酸阿霉素均具有较高的耐药性（RI值分别为310和94），且外排蛋白P-gp在两种耐药细胞株中均具有较高表达。与敏感细胞相比，耐药乳腺癌细胞线粒体的网状结构被破坏，呈点状分布于细胞质中;MDA-MB-231/DOX细胞的线粒体生物发生蛋白PGC-1α的表达明显降低;耐药乳腺癌细胞内的ATP含量更高。MDA-MB-231/DOX耐药细胞中的ROS、GSH、NADPH、NADH含量分别是其敏感细胞的3.73倍（p＜0.05）、0.91倍、0.72倍（p＜0.01）、0.72倍（p＜0.01）;MCF-7/ADR耐药细胞中的ROS、GSH、NADPH、NADH含量分别是其敏感细胞的0.58倍（p＜0.05）、0.61倍（p＜0.01）、1.65倍（p＜0.05）、1.30倍（p＜0.001）。具有抗氧化功能的核心转录因子Nrf2在MDA-MB-231/DOX细胞和MCF-7/ADR细胞的细胞核中的表达水平上调。 柴胡皂苷D（1-14μM）对四种乳腺癌细胞无明显细胞毒性作用，与盐酸阿霉素联用后，能有效降低耐药细胞MDA-MB-231/DOX和MCF-7/ADR的生存率（14μM柴胡皂苷D在两种细胞上的RI值分别为1.87和2.08），显著抑制两种耐药细胞的集落克隆形成和MCF-7/ADR肿瘤球生长，促进盐酸阿霉素诱导的MDA-MB-231/DOX和MCF-7/ADR细胞凋亡作用。此外，柴胡皂苷D还可增加盐酸阿霉素对荷瘤裸鼠模型肿瘤的生长抑制作用（5mg/kg柴胡皂苷D+盐酸阿霉素组、10mg/kg柴胡皂苷D+盐酸阿霉素组的抑瘤率分别是盐酸阿霉素单用组的5.89倍、6.60倍）。 柴胡皂苷D抗耐药肿瘤的作用机制如下:下调P-gp外排蛋白表达水平，从而增加盐酸阿霉素在耐药细胞内的蓄积和毒性;增加耐药细胞内ROS的积累，减少耐药细胞中抗氧化物质GSH、NDAPH、NADH的生成，从而引起严重的氧化应激，一方面致使线粒体膜电位丧失、启动Caspase3细胞凋亡通路以诱导癌细胞死亡，另一方面将耐药细胞周期阻滞于G1期，从而阻断耐药乳腺癌细胞的生长和增殖进程。 结论:本研究显示，耐药乳腺癌细胞的线粒体形态异常，且其氧化-还原体系状态与敏感细胞有明显差异;中药活性成分柴胡皂苷D具有增强盐酸阿霉素抗耐药乳腺癌肿瘤的作用，其机制与柴胡皂苷D能有效破坏耐药肿瘤细胞氧化-还原平衡体系有关;为从氧化应激角度寻找克服肿瘤耐药性的天然活性成分提供参考与借鉴。
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