摘要
研究背景: 霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng是兰科石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，首次以霍山石斛(StemofDendrobiumhuoshanense)收录于2020版《中华人民共和国药典》，具有益胃生津、滋阴清热的功效，用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明和筋骨痿软等症。现代药理学研究表明霍山石斛具有免疫调节、抗肿瘤、保肝、降糖、抗氧化和抗白内障等多种药理活性。2020年版《中华人民共和国药典》记载霍山石斛鲜品或加工为枫斗后入药，沿用了历史上石斛干、鲜两用，以干品入药居多的药用习惯。 关于石斛的鲜/干用药，清代凌奂著《本草害利》明确记载:“虚证宜干，实证宜鲜”，推测石斛在加工成枫斗的过程中，一些热敏性化学成分可能发生转化，从而改变其药性。霍山石斛是一种药用历史悠久的鲜/干两用中药，且多糖被大量报道为霍山石斛中的主要活性物质。但是近年来有关其鲜品在炮制加工成干品后化学成分变化仍未受到十分关注，更鲜有对霍山石斛小分子化学成分的化学成分及活性对比研究的报道。基于此，本论文在霍山石斛化学成分定性表征的基础上，对霍山石斛鲜品(Freshstem，Fs)/干品(Fengdou,Fd)的小分子化学成分进行差异性分析，并基于体内外药效评价，比较霍山石斛鲜/干品的抗炎活性。 研究方法: 1.利用MCI柱色谱制备霍山石斛鲜/干品各个化学部位，对不同类型的小分子化学成分初步分离富集，同时充分暴露微量成分。分别建立各个化学部位的UPLC-Q-TOF-MSE分析方法，并结合课题组自建石斛属化学成分数据库、二级裂解规律、参考文献报道、对照品比对表征、鉴定各个化学部位主要物质群。 2.优化霍山石斛小分子化学成分提取方法，使简化提取方法、提高提取效率且便于质量控制。建立超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(Ultra-HighPerformanceLiquidChromatographyQuadrupole/Time-of-FlightMassSpectrometry，UPLC-Q-TOF-MSE)霍山石斛小分子化学成分的整体分析方法，结合代谢组学多元统计分析方法对霍山石斛鲜/干品小分子化学成分进行差异性分析。 3.采用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(Methionineandcholinedeficient,MCD)连续喂养6周小鼠诱导NAFLD模型，并在后4周连续给药霍山石斛提取物(含生药材量6.82g/kg/d)。后续通过检测小鼠血清中谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvictransaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamicoxalacetictransaminase，AST)活力，小鼠肝脏中甘油三酯(Triglyceride,TG)、游离脂肪酸(Non-esterifiedfattyacid,NEFA)含量及髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活力的生理生化指标;并对肝脏病理切片进行苏木精&伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色、油红O染色、LY-6G免疫组化标记观察肝脏病理变化，评价霍山石斛改善MCD诱导小鼠NAFLD的药效。 4.筛选DMSO诱导浓度、诱导时间刺激HL-60细胞大量分化为类中性粒细胞，流式细胞仪测cd11b表达量;筛选LPS浓度刺激HL-60细胞产生呼吸爆发，用荧光探针对释放的大量ROS进行测定，与对照组相比，模型组的ROS水平需显著升高，从而建立类中性粒细胞炎症模型，评价对霍山石斛鲜/干品的各个化学部位抗炎活性。 实验结果: 1.利用MCI柱色谱将霍山石斛鲜/干品75％及95％乙醇提取物分别划分为30％(Fs/Fd30％)、50％(Fs/Fd50％)、60％(Fs/Fd60％)、90％(Fs/Fd90％)甲醇洗脱部位。对各个部位分别建立UPLC-Q-TOF-MSE分析方法进行数据采集并基于课题组自建的石斛属植物质谱数据库，通过比对化合物保留时间、相对分子质量、二级质谱裂解碎片及对照品比对，共鉴定出98个化学成分，包含18个联苄、17个倍半萜、15个简单苯丙素、11个木脂素、10个黄酮、6个菲、4个生物碱、1个蒽醌和16个其他类型的化合物。其中，Fs/Fd30％部位主要富集倍半萜、简单苯丙素苷;Fs/Fd50％主要富集木脂素苷、黄酮碳苷;Fs/Fd60％与Fs/Fd50％相似但多鉴定出部分生物碱;Fs/Fd90％主要富集了联苄、菲、黄酮苷元。 2.对于霍山石斛鲜/干品小分子化学成分的UPLC-Q-TOF-MSE半定量差异性分析的结果显示，霍山石斛鲜条与霍山石斛枫斗的小分子的整体代谢轮廓图并不是完全相似的。并且二者PCA结果显示，霍山石斛鲜/干品基本被分为两类。通过有七倍交叉验证的OPLS-DA模型按照VIP＞1，P＜0.05筛选出了加工前后75个发生显著变化的化学成分，表征与鉴定了其中12个化学成分。其中，霍山石斛鲜条经加工后双吲哚型生物碱及木脂素、倍半萜、联苄等氧苷含量显著降低，而大黄素、柚皮素、联苄苷元含量显著增加。 3.体内考察霍山石斛改善MCD诱导小鼠NASH的结果显示，霍山石斛(含生药材6.82g/kg)没有显著降低MCD诱导NASH小鼠血清中升高的ALT、AST酶活力;对肝脏组织中升高的TG、NEFA含量影响不大，没有显著减少肝脏组织中脂质的堆积，表明霍山石斛对MCD诱导小鼠NASH的脂质堆积没有明显的改善作用。但是，霍山石斛能够显著减低MCD诱导NASH小鼠肝脏组织中升高的MPO酶活力，减轻中性粒细胞聚集，表明霍山石斛对中性粒细胞介导的肝脏炎症有一定的改善作用，显示一定的体内抗炎作用。 4.通过1.5％DMSO诱导分化6天成功使HL-60细胞cd11b表达量达到92.55％;通过1μg/mL的LPS刺激HL-60类中性粒细胞使ROS水平显著升高，建立体外炎症模型，并在模型上筛选安全给药浓度;在安全浓度下给药，测定各组ROS含量。ROS含量检测结果显示，枫斗中的Fd30％、Fd90％、Fd50％、Fd60％部位及鲜条中的Fs30％、Fs90％能够显著降低HL-60类中性粒细胞升高ROS水平，均表现出一定的抗炎活性，且以Fd30％、Fd90％抗炎活性最佳，Fs90％、Fd50％、Fd60％、Fs30％其次;枫斗中Fd50％、Fd60％的抗炎活性显著优于鲜条中Fs50％、Fs60％部位。上述实验结果初步表明枫斗各活性部位的抗炎活性整体强于鲜条。 实验结论: 1.霍山石斛鲜条加工为枫斗后，小分子化学成分发生了一定变化，双吲哚型生物碱及木脂素、倍半萜、联苄等氧苷含量显著降低，而蒽醌、黄酮、联苄苷元含量显著增加。 2.霍山石斛在MCD诱导的NAFLD疾病发展过程中可显著改善中性粒细胞介导的肝脏炎症。从改善中性粒细胞介导的炎症效应的角度出发，霍山石斛干品的小分子化学成分显著优于鲜品的成分。且霍山石斛枫斗抗炎活性更好的原因可能是加工后黄酮、菲、联苄等未糖基化小分子化学成分含量升高，枫斗中的给药部位在相同浓度下可能富集更多黄酮、菲、联苄等未糖基化小分子，但木脂素氧苷、联苄苷、倍半萜可能与霍山石斛改善中性粒细胞介导的炎症效应联系较弱，许多未鉴定出来的差异成分可能也会影响抗炎活性的强弱。
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