摘要
目的: 青藤碱(sinomenine，SIN)是治疗类风湿关节炎常用中成药正清风痛宁的主要成分。本论文以代谢途径、药物动力学(pharmacokinetics，PK)和体内外主要药效作用研究为主要切入点，旨在探究SIN在人和大鼠体内代谢途径、长期给药大鼠体内吸收和排泄环节的药物动力学特征及治疗大鼠类风湿关节炎的药效和作用机制。 方法: 1对SIN在大鼠体内的代谢轮廓进行考察分析，鉴定并合成主要代谢物，在体外进行酶和非酶体系孵育实验验证主要代谢产物并探索SIN的酶和非酶代谢途径，并进行SIN酶动力学研究。 2考察SIN和主要代谢物对LPS(lipopolysaccharides)诱导的RAW264.7炎症细胞模型的抗炎作用及代谢物N-氧化青藤碱(sinomenine-N-oxide，SNO)的氧化性。 3进行SIN药物动力学实验，考察灌胃盐酸青藤碱后原型和主要代谢物在大鼠体内的PK特征参数以及尿液、胆汁排泄特征的性别差异，同时考察长期给药和疾病状态下的SIN和主要代谢物的PK特征差异。 4建立大鼠胶原诱导类风关(collagen-induced arthritis，CIA)模型，长期灌胃盐酸青藤碱后考察其治疗类风湿关节炎的药效指标变化情况，包括:四肢肿胀、病理状况、软骨量、滑膜中巨噬细胞数量和血清中炎症因子浓度等，并考察MAPK/AP-1信号通路相关蛋白表达量的变化，同时探究疾病状态和不同给药方案下主要代谢酶CYP2C11、CYP3A1和CYP3A2和转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达量变化。 结果: 1 SIN的代谢存在种属差异和性别差异，其在大鼠体内外的主要代谢产物为去甲基青藤碱(N-demethylsinomenine，DS)和 SNO。在 CYP3A4和 CYP2C19的作用下，SIN主要发生脱甲基化作用生成DS;在CYP3A4和活性氧(reactive oxygenspecies,ROS）的作用下，SIN主要发生氮氧化反应生成SNO。此外，酶[P450s和黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）]和非酶（Fe2+和血红素）介导SNO的代谢生成SIN。 2 SIN、SNO和DS均能够减轻LPS诱导的炎症反应，其中SIN抗炎作用最强。在LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型中，10μM的SNO能显著性诱导ROS的生成，故大量SIN给药后可能带来机体的氧化应激和损伤。 3建立了 UPLC-MS/MS检测方法用来测定血浆、尿液和胆汁中SIN、DS和SNO的浓度，并通过了方法学验证。比较各组大鼠PK参数，发现性别、疾病状态和给药周期是影响SIN和DS的PK参数发生变化的显著性因素:雄性大鼠比雌性大鼠血浆中SIN浓度低、半衰期短、消除快、生物利用度低，CIA模型大鼠比空白大鼠血浆中SIN半衰期长、消除慢。雄性大鼠比雌性大鼠血浆中DS浓度高、达峰快、半衰期短、消除快。CIA模型大鼠比空白大鼠血浆中DS半衰期短、消除快。性别是影响SNO的PK参数发生变化的显著性因素:雄性大鼠比雌性大鼠血浆中SNO浓度低、半衰期短、消除快。SIN和DS在尿液和胆汁的累积排泄量也存在性别差异，雄性大鼠尿液中DS的累积排泄量大于SIN，而雌性大鼠则反之。雄性大鼠胆汁中DS的累积排泄量远大于SIN,而雌性大鼠中则相差不大。 4通过药效学研究发现，CIA模型大鼠与对照组大鼠相比，踝关节距骨软骨变薄、滑膜中巨噬细胞数量增多，血清中细胞因子IL-1β和TNF-α浓度升高;MTX和SIN灌胃6周后，可以逆转这些指标，病理进程好转、距骨软骨增厚、滑膜中巨噬细胞数量减少，血清中细胞因子IL-1β和TNF-α浓度降低。SIN可通过调控MAPK/AP-1信号通路并使滑膜中p-p38、p-JNK、p-ERK和AP-1蛋白表达水平降低来发挥治疗类风湿关节炎作用。 5通过免疫印迹法（Western blot）测定大鼠肝脏、小肠组织中代谢酶CYP2C11、CYP3A1和CYP3A2以及转运体P-gp的蛋白表达水平。结果显示，与对照组相比，雄性CIA模型组大鼠肝脏中CYP3A1和CYP3A2的表达显著降低，雄性CIA模型组大鼠空肠中P-gp的表达显著降低，提示类风湿关节炎对代谢酶（CYP3A1和CYP3A2）和转运体（P-gp）的表达有下调作用。与CIA模型组比较，雄性SIN给药组CIA大鼠肝脏中CYP2C11和CYP3A2的表达水平明显下降，雄性SIN给药组CIA大鼠空肠中CYP2C11和P-gp的表达水平明显下降。雌性SIN给药组CIA大鼠肝脏中CYP3A1的表达水平明显下降，说明长期灌胃盐酸青藤碱可下调大鼠部分代谢酶（CYP2C11、CYP3A1和CYP3A2）和转运体（P-gp）的表达从而引起PK参数的变化。 结论: 通过对SIN的代谢途径、药物动力学和体内外主要药效作用研究，显示SIN在体内外主要代谢产物为DS和SNO。在CYP3A4和CYP2C19的作用下，SIN主要发生脱甲基化作用生成DS;在CYP3A4和ROS的作用下，SIN主要发生氮氧化反应生成SNO;SNO还可在酶（P450s和XOD）和非酶（Fe2+和血红素）的介导作用下代谢生成SIN。原型及两种代谢物的抗炎作用存在差别且代谢产物SNO存在氧化性。PK研究发现SIN体内处置过程（吸收、代谢和排泄）存在种属、性别差异，同时给药周期和疾病状态会影响其PK参数。药效学研究发现，SIN可通过增厚关节软骨、降低滑膜中巨噬细胞数量、降低血清中细胞因子IL-1β和TNF-α浓度、降低滑膜中MAPK/AP-1通路相关蛋白表达水平等途径对类风湿关节炎发挥治疗作用。同时，本研究发现疾病状态和长期灌胃盐酸青藤碱可下调大鼠肝脏和空肠内部分代谢酶和转运体的表达水平，推测是PK参数变化的潜在原因，也提示药物合用时需要考虑药物（草药）-药物相互作用（DDI/HDI）。
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